吴瑞霞,黄 粮,白玉鹏,刘晓刚,胡立群
(武汉市第四医院心血管内科, 湖北 武汉 430000)
微小RNA(microRNA,miRNA,miR)为18~25个核苷酸之间的内源性短链非编码RNA分子,是一类参与细胞凋亡的重要调节因子[1]。氧化应激诱导的细胞凋亡是导致心肌炎性损伤的主要因素。之前很多研究已经证明miR-153在肿瘤中具有抗肿瘤作用[2]。然而,miR-153是否参与脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的心肌细胞损伤过程及机制仍有待阐明。Sorbin和SH3结构域包含蛋白2(Sorbin and SH3 domain-containing protein 2,SORBS2)基因位于4p35.1,在心肌的Z带表达,为一种衔接蛋白[3-4]。本研究拟以LPS诱导的心肌H9C2细胞为研究对象,检测其中miR-153和SORBS2的表达,观察抑制miR-153、过表达或抑制SORBS2对LPS诱导的H9C2细胞活力、炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)及凋亡的影响,揭示其机制与靶向SORBS2有关,将为心脏疾病的治疗提供参考。
DMEM培养基、胎牛血清、MTT和胰蛋白酶均购自Sellect;LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量试剂盒和逆转录试剂盒购自TaKaRa;PVDF膜购自Roche;TNF-α检测试剂盒、IL-6检测试剂盒、SDS-PAGE 试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司;双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。
2.1心肌H9C2细胞损伤模型的建立及分组 用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养胚胎大鼠心肌H9C2细胞,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中常规培养。参考刘峰等[5]的实验选用500 μg/L LPS与对数生长期的H9C2细胞共处理48 h,标记为LPS组。用等剂量的PBS与H9C2细胞共培养48 h,标记为PBS组。运用脂质体将anti-miR-Con、anti-miR-153、pcDNA、pcDNA-SORBS2、anti-miR-153+si-Con和anti-miR-153+si-SORBS2转染至H9C2细胞,转染6 h后,在进行LPS诱导处理48 h,分别标记为anti-miR-Con组、anti-miR-153组、pcDNA组、pcDNA-SORBS2组、anti-miR-153+si-Con组和anti-miR-153+si-SORBS2组。
2.2RT-qPCR实验检测H9C2细胞中miR-153和SORBS2 mRNA的表达 TRIzol法提取对数生长期的细胞样本总RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度计进行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆转录反应采用逆转录试剂盒方式,操作按照试剂盒说明书进行,合成模板链cDNA。按照反应体系进行,反应结束后通过分析Ct值,计算定量结果,以2-ΔΔCt法测定miR-124-3p的相对表达水平。每个样品重复3次,取平均值,实验重复2次。miR-124-3p的上游引物序列为5′-GCGGCGGTAAGGCACGCGGTG-3′,下游引物序列为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′;内参照U6的上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;SORBS2的上游引物序列为5′-AAATCACCATGCCCTCTACAAG-3′,下游引物序列为5′-CCCACTTTTATCACCATCGCAA-3′;内参照GAPDH的上游引物序列为5′-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′,下游引物序列为5′-GCGCCCCAATACGACCAAATC-3′。
2.3Western blot检测H9C2细胞中SORBS2的蛋白表达 取适量对数生长期的H9C2细胞,RIPA裂解后用BCA进行定量,变性离心后取上清进行蛋白上样。按照Western blot实验常规操作流程进行电泳-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-显影曝光。ImageJ分析目的条带的灰度值,以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达。
2.4ELISA实验检测H9C2细胞中TNF-α和IL-6的含量 按TNF-α检测试剂盒和IL-6检测试剂盒要求进行TNF-α和IL-6的检测。每个样品重复3次,取平均值,实验重复2次。
2.5流式细胞术检测H9C2细胞的凋亡 将2.1各转染组细胞,用 500 μL 的binding buffer悬浮细胞,加入5 μL的annexin V-FITC避光反应20 min后再加入5 μL的PI避光反应20 min,用300目铜筛过滤,最后在1 h内上流式细胞仪结束检测。细胞的凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品做3个平行实验,实验重复2次。
2.6双萤光素酶报告基因实验检测H9C2细胞中miR-153与SORBS2的结合力 取适量对数生长期的H9C2细胞,按照双萤光素酶报告基因检测试剂盒操作说明书要求进行操作,以psiCHECK2-SORBS2-3’UTR WT和psiCHECK2-SORBS2-3’UTR MUT的表达为对照,观察miR-153对SORBS2表达的影响。
2.7MTT实验检测细胞活力 收集需要检测的细胞,取105个每孔的密度分别加入96孔板中,培养24 h后,加入MTT试剂再培养4 h,最后加入DMSO结晶紫染色。将酶标仪设置为450 nm波长,检测细胞的吸光度(A)值。
采用SPSS 21.0软件进行统计分析。所得实验数据以均值±标准差(mean±SD)表示,每组数据代表3个生物学重复,每个生物学重复包括2个技术重复。两组间均数比较采用t检验;多组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。
与PBS组相比,LPS组H9C2细胞中miR-153的表达显著升高,SORBS2的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05),见图1。这表明LPS刺激后心肌H9C2细胞miR-153的表达增加,伴随SORBS2表达的下调。
Figure 1. The changes of miR-153 and SORBS2 expression in the H9C2 cells. A: the expression level of miR-153 was detected by RT-qPCR; B: the mRNA expression of SORBS2 was detected by RT-qPCR; C: the protein level of SORBS2 was detected by Westerm blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group.
图1 心肌细胞中miR-153和SORBS2表达的变化
与PBS组相比,LPS组H9C2细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著升高;与LPS+anti-miR-con组相比,LPS+anti-miR-153组H9C2细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著降低(P<0.05),见图2。这一结果提示miR-153可促进LPS刺激诱导的细胞因子释放。
Figure 2. The effect of miR-153 on the secretion of inflammatory factors TNF-α and IL-6 in the H9C2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group.
图2 miR-153的表达对心肌H9C2细胞炎症因子TNF-α和IL-6分泌的影响
与PBS组相比,LPS组H9C2细胞中细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高;与LPS+anti-miR-Con组相比,LPS+anti-miR-153组细胞中细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),见图3。这一结果提示miR-153可抑制LPS刺激诱导的细胞活力,促进凋亡。
Figure 3. The changes of the viability (A) and apoptosis (B) of the H9C2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group.
图3 心肌H9C2细胞活力和凋亡的变化
运用miRcode数据库预测到miR-153与SORBS2 3’UTR存在结合位点,见图4A。双萤光素酶活性检测结果显示,与miR-NC组相比,miR-153组WT-SORBS2细胞中萤光素酶活性显著降低,MUT-SORBS2细胞中萤光素酶活性不受影响,见图4B。与miR-Con组相比,miR-153组细胞中SORBS2表达显著降低; 与anti-miR-Con组相比,anti-miR-153组细胞中SORBS2表达显著升高(P<0.05),见图4C。上述结果提示,miR-153可靶向调控SORBS2。
Figure 4. miR-153 targeted the 3’UTR of SORBS2 mRNA to regulate its protein expression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsmiR-Con group;#P<0.05vsanti-miR-Con group.
图4 miR-153靶向H9C2细胞SORBS2 mRNA 3’UTR而调控其蛋白表达
与LPS+pcDNA组相比,LPS+pcDNA-SORBS2组H9C2细胞中SORBS2的蛋白表达显著升高,TNF-α和IL-6的含量均显著降低,细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),见图5。这一结果提示SORBS2可抑制LPS诱导的细胞因子释放和细胞凋亡。
Figure 5. The effects of SORBS2 protein over-expression on the releases of TNF-α and IL-6, cell viability and apoptosis of H9C2 cells. A: the protein level of SORBS2 was detected by Western blot; B and C: the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA; D: the cell viability was detected by MTT assay; E: the apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsLPS+pcDNA group.
图5 心肌H9C2细胞SORBS2蛋白过表达对TNF-α和IL-6释放、细胞活力和凋亡的影响
与 LPS+anti-miR-Con组相比,LPS+anti-miR-153组的H9C2细胞中SORBS2蛋白表达显著升高,TNF-α和IL-6的含量均显著降低,细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低;与LPS+anti-miR-153+si-Con组相比,LPS+anti-miR-153+si-SORBS2组的H9C2细胞中SORBS2蛋白表达显著降低,TNF-α和IL-6的含量均显著升高,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),见图6。上述结果提示,miR-153通过抑制SORBS2的表达,促进LPS诱导的细胞因子释放和细胞凋亡。
Figure 6. The effects ofSORBS2expression knock-down on the releases of TNF-α and IL-6, cell viability and apoptosis of H9C2 cells with inhibition of miR-153 expression. A: the protein level of SORBS2 was detected by Western blot; B and C: the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA; D: the cell viability was detected by MTT assay; E: the apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-153+si-Con group.
图6 敲减心肌H9C2细胞中SORBS2表达对抑制miR-153产生的生物学效应的影响
据报道,很多miRNA参与了多种心脏疾病的发展,有报道称miRNA不仅控制心律失常的发生,而且还参与心肌细胞死亡的调控[6-8]。此前,miR-153已被证明可以抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移[9-11]。尽管已经在肿瘤细胞中发现了几个靶点,miR-153在心肌细胞中的作用机制仍有待充分阐明。Zou等[12]在心肌缺血再灌注损伤的研究中发现,H2O2刺激下miR-153的表达明显增加,并且内源miR-153的抑制可减少细胞的凋亡,miR-153抑制氧化应激过程中的自噬,并且Mcl-1小干扰RNA有效地消除了其自噬诱导和凋亡抑制的作用,阐明了miR-153通过细胞凋亡和自噬调节氧化应激过程中心肌细胞存活的新机制,其与靶向Mcl-1直接介导密切相关,提示miR-153在治疗心血管疾病中的潜在临床价值。本研究构建了LPS诱导的H9C2细胞损伤模型,通过RT-qPCR法检测发现,miR-153的表达异常的升高,这与Zou研究的结果相一致;深入研究发现,抑制miR-153可下调炎症因子TNF-α和IL-6的表达,促进细胞活力,抑制细胞凋亡,这是首次报道miR-153对心肌细胞损伤的炎症反应和凋亡的影响,为miR-153在心肌损伤中的功能研究及机制探索奠定了基础,推进了miR-153在心血管疾病中潜在治疗价值的进一步深入研究。通过生物信息学分析和双萤光素酶报告基因实验验证miR-153可靶向负调控SORBS2,这说明miR-153的作用与调控下游基因SORBS2有关,揭示了靶向SORBS2为miR-153在心肌细胞中的调控网络之一。
SORBS2在机体多种组织中广泛表达,尤其在心脏中表达最高,其参与细胞信号通路、细胞骨架[13]。赵颖等[14]运用高效液相色谱法对先天性心脏患者组织标本进行分析发现,SORBS2在心脏中的表达量异常升高,且其对先天性心脏病的影响不显著,但是推测出SORBS2在心肌病变等心脏疾病中具有一定的作用。Kakimoto等[15]发现,SORBS2在心肌梗死患者组织中表现出异常降低。王惠等[16]通过腹腔注射LPS制造脓毒性心肌病小鼠模型,通过miRNAs芯片筛选发现,miR-21-3p表达异常升高,且与SORBS2存在内源性靶向调控关系,共同发挥对小鼠心功能、自噬、线粒体及生存的调控,揭示了miR-21-3p通过靶向抑制SORBS2调控脓毒症心肌病的发生发展。本研究检测了LPS诱导的H9C2细胞中SORBS2的表达发现,SORBS2异常降低,这与赵颖、王惠的研究结果相呼应,也是国内外首次公开报道SORBS2在体外炎性心肌细胞中的异常表达,为进一步进行SORBS2的体外功能研究奠定了基础。进一步研究发现,过表达SORBS2可下调炎性因子TNF-α和IL-6的表达,促进细胞活力,抑制细胞凋亡,这些研究结果说明SORBS2参与炎症心肌细胞的生长、炎症及凋亡过程,为研究SORBS2的作用机制提供参考依据,推测SORBS2具有心血管疾病治疗的潜力。此研究还发现,抑制SORBS2可逆转抑制miR-153对LPS诱导H9C2细胞抗炎、抗凋亡及提高细胞活力的作用。
综上所述,miR-153可加重心肌细胞的损伤,其机制与靶向SORBS2有关。本研究可能为心血管疾病的治疗提供新靶点。