TRIM25泛素化IGF2BP3后抑制食管癌EC109细胞的活力*

曾 涛，温剑虎，王继相

(1 四川绵阳四○四医院胸外科， 四川 绵阳 621000; 2重庆医科大学附属第一医院胸心外科， 重庆 400016)

泛素化是一种多翻译后特异性修饰过程，其在多种细胞进程中发挥调控作用，包括细胞周期，细胞增殖，DNA复制和细胞凋亡等[1]。越来越多的证据表明，泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)在肿瘤的发展中起着重要作用[2]。在泛素化过程中，泛素连接酶能够将泛素分子与目的蛋白连接起来。泛素连接酶含三重基序蛋白25(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)被认为与多种肿瘤有关，其可能通过泛素蛋白酶体系统靶向细胞周期来调控肿瘤细胞的生长[3]。值得注意的是，TRIM25在具有较低TRIM25表达的GC细胞系中的异位表达能够显著促进其迁移和侵袭。另一方面，已有报道显示胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3，IGF2BP3)也能通过局部翻译IGF2BP3结合的转录物促进肿瘤细胞的侵袭和转移[4]。Choudhury等[5]通过免疫沉淀TRIM25后质谱分析暗示了TRIM25和IGF2BP3可能存在相互作用。同时，食管癌中存在TRIM25低表达且IGF2BP3高表达的现象[6]。因此，为了探究TRIM23和IGF2BP3表达与食管癌EC109细胞活力的关系，我们进行了如下研究。

材 料 和 方 法

1 实验材料

人食管癌细胞系EC109购自中科院上海细胞库(货号 3111C0001CCC000246)。IGF2BP3和ubiquitin (UB)的质粒购自北京中原公司(ADDGNE货号 #19879和#74218)；TRIM25的质粒购自上海权阳生物有限公司(货号TC07931)；Lipofectamine 2000(货号11668027)和胎牛血清(货号10099-133)购自Thermo Fisher Scientific；RPMI-1640培养基购自GE Health(货号SH30091)；抗IGF2BP3、TRIM25、MYC和HA抗体购自CST(货号 57145、13773、2276和3724)；Protein A/G免疫沉淀磁珠(货号B23201)和蛋白酶抑制剂Cocktail(不含EDTA，mini片剂)购自Bimake(货号B14011)；蛋白酶体抑制剂MG132购自SELLECK(货号S2619)；PBS购自生工生物工程(上海)股份有限公司(货号E607008)；青链霉素混合液(100×)购自北京索莱宝科技有限公司(货号P1400)；2×SDS 蛋白电泳上样缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(货号WB-0081)；蛋白裂解液购自碧云天生物技术有限公司(货号P0013)；TRIM25的siRNA序列为5’-AGGCUCUGUUCAAUCUCCUC-3’，IGF2BP3的siRNA序列为5’-CCAUAAAUUCUUCCCUGAGC-3’，由上海生工合成。

Western blot装置(Bio-Rad)；酶标仪、细胞培养箱和生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)；微量加样器(Gilson)；冷冻离心机(Eppendorf)；旋转摇床(海门其林贝尔)；脱色摇床(北京大龙)。

2 实验方法

2.1细胞培养和药物处理 将食管癌EC109细胞分为过表达TRIM25组、过表达IGF2BP3组、敲减TRIM25组和敲减IGF2BP3表达且过表达TRIM25组。食管癌EC109细胞维持在含有2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素和10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基中，并在潮湿气氛(37 ℃、5% CO2)中培养。环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)以终浓度40 mg/L处理EC109细胞；MG132以终浓度为5 μmol/L处理EC109细胞，8 h后收获细胞。

2.2细胞转染 通过Lipofectamine 2000转染EC109细胞。将含目的基因的质粒与脂质体混合静止大约20 min后，缓缓滴入EC109细胞。于12孔板中实施剂量依赖性实验。

2.3Western blot实验 进行10%或12%SDS-PAGE，然后转移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔径)。将PVDF膜在室温下用含有0.01%Tween-20和5%脱脂奶粉的Tris缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl)封闭1 h，然后在4 ℃下与目的蛋白的抗体温育过夜。然后将膜在室温下与缀合有HRP的相应 II 抗孵育1 h。观察特定蛋白质使用ECL Plus Western blot检测系统。

2.4免疫共沉淀实验 EC109细胞在1 mL NP-40裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% Nonidet P-40, 10 mg/L抑肽酶，10 mg/L亮抑酶肽和1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中裂解。在14 000×g，4 ℃条件下离心15 min，立即将上清液转移到新管中。用PBS洗涤Protein A/G琼脂糖珠2次，并制成50% Protein A/G琼脂糖工作液(PBS中)。 在水平振荡器上4 ℃振荡10 min(此步骤旨在消除非特异性结合蛋白)。在14 000×g、4 ℃条件下离心15 s，将上清液转移到新管中并丢弃Protein A/G琼脂糖。加入适量的Ⅰ抗至总体积约500 μL。旋转振荡器上于4 ℃缓慢摇动过夜。在14 000×g、4 ℃条件下离心15 s，保持沉淀并用预先冷却的洗涤缓冲液(或冷PBS)洗涤3次。加入15 μL SDS-loading buffer，100 ℃水浴5 min后取7 μL进行Western blot分析。

2.5MTT实验检测细胞活力 第1天用胰蛋白酶消化EC109细胞，将EC109细胞稀释至 7.5×107/L(使用完全培养基稀释细胞)。向96孔板的每孔中加入100 μL细胞(总共7 500个细胞)并孵育过夜。第2天处理细胞，且最终每孔体积为100 μL。第3天，向每个孔中加入20 μL MTT(5 g/L),包括一组加入MTT但没有细胞的孔(对照)。在培养箱中37 ℃孵育3.5 h。小心取出96孔板，加入150 μL DMSO，用锡箔覆盖并在轨道振荡器上搅拌细胞15 min。在酶标仪中读取590 nm处的吸光度(A)值。

2.6CCK-8实验检测细胞活力 在96孔板中分配100 μL EC109细胞悬浮液(每孔5 000个)。将板在潮湿的培养箱中预孵育24 h(37 ℃、5% CO2条件下)。将10 μL不同浓度的待测物质加入板中。将培养板在培养箱中孵育适当的时间(0 d、1 d、2 d、3 d和4 d)。向板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱中孵育4 h。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度值。

3 统计学处理

使用library(VIM)中aggr(env, prop=T, numbers=T) 函数将信息缺失比例大于20%的无效信息可视化后手工剔除，用最高频率或通过变量的相关关系填补缺失值后先录入Epidata建立数据库，再导入SPSS 23.0进行统计分析。计量数据用均数±标准差(mean±SD)表示。MTT和CCK-8实验中组间比较使用三因素方差分析(three-way ANOVA)；蛋白条带通过ImageJ软件定量后组间差异采用Student’st检验分析。计数数据用例数(n)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 过表达TRIM25抑制食管癌EC109细胞的活力

MTT实验结果显示，与vector组相比，转染0.5、1和2 μg HIS-TRIM25后，食管癌EC109细胞的活力在第2天和第3天受到明显抑制；且随着TRIM25表达量的升高，食管癌EC109细胞的活力抑制越明显(P<0.01)，见图1。CCK-8实验结果显示，过表达TRIM25后EC109细胞的活力在第2天、第3天和第4天受到明显抑制(P<0.05);而敲减TRIM25表达对EC109细胞的活力在第2天、第3天和第4天有明显的促进效应(P<0.05)，见图2。

Figure 1. Over-expression of TRIM25 inhibited the viability of EC109 cells (measured by MTT assay). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group at the same time point.
图1 MTT法检测过表达TRIM25对食管癌EC109细胞活力的抑制作用

Figure 2. The changes of EC109 cell viability measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group at the same time point.
图2 CCK-8法检测EC109细胞活力的变化

2 过表达IGF2BP3促进食管癌细胞的活力

MTT实验结果显示，与vector组相比，转染0.5、1和2 μg MYC-IGF2BP3对食管癌EC109细胞的活力在第2天和第3天有明显的促进效应，且随着IGF2BP3表达量的升高,EC109细胞活力的增高越明显(P<0.01)，见图3。CCK-8实验结果显示，过表达IGF2BP3后，EC109细胞的活力在第2天、第3天和第4天明显增高(P<0.05);敲减IGF2BP3表达后，EC109细胞的活力在第2天、第3天和第4天受到明显抑制(P<0.05)，见图4。

Figure 3. Over-expression of TRIM25 promoted the viability of EC109 cells (measured by MTT assay). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group at the same time point.
图3 过表达TRIM25促进食管癌细胞的活力

Figure 4. The changes of EC109 cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group at the same time point.
图4 CCK-8法检测EC109细胞活力的变化

3 敲减IGF2BP3表达和过表达TRIM25对食管癌EC109细胞的活力无明显影响

过表达TRIM25后EC109细胞的活力受到了抑制(P<0.05)，与前面的结果相吻合； 敲减IGF2BP3表达抑制EC109细胞的活力(P<0.05)，也与前面的结果相吻合;敲减IGF2BP3表达的同时过表达TRIM25可抑制EC109细胞的活力，但其抑制程度与单纯敲减IGF2BP3表达的EC109细胞相比差异无统计学显著性(P>0.05)， 见图5。

Figure 5. No significant change in the viability of esophageal cancer EC109 cells when knock-down ofIGF2BP3expression and over-expression of TRIM25 measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
图5 敲减IGF2BP3表达同时过表达TRIM25对食管癌细胞的活力无明显影响

4 过表达TRIM25导致IGF2BP3的表达量减少

当梯度过表达TRIM25时，内源IGF2BP3的表达量会梯度减少，提示泛素E3连接酶TRIM25会对 IGF2BP3进行泛素化修饰，且修饰后的IGF2BP3会被蛋白酶体降解,见图6。

Figure 6. Over-expression of TRIM25 resulted in reducing IGF2BP3 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.
图6 过表达TRIM25导致IGF2BP3的表达量减少

5 过表达TRIM25后用MG132处理食管癌细胞，IGF2BP3的表达量无明显变化

当用蛋白酶体抑制剂MG132处理食管癌EC109细胞时，即使梯度过表达TRIM25，IGF2BP3的表达量也没有减少，见图7。这表明TRIM25对IGF2BP3表达量的影响是蛋白酶体依赖性的。

Figure 7. The expression of IGF2BP3 in EC109 cells treated with MG132 after over-expression of TRIM25. Mean±SD.n=3.
图7 过表达TRIM25后用MG132处理食管癌细胞，IGF2BP3的表达量无明显变化

6 TRIM25与IGF2BP3存在相互作用

在只转染HIS-TRIM25和空载体的对照组中，未能检测到TRIM25的存在，只有当MYC-IGF2BP3和HIS-TRIM25共转染时才能检测到HIS-TRIM25, 说明TRIM25与IGF2BP3存在相互作用，见图8。

Figure 8. TRIM25 interacted with IGF2BP3.
图8 TRIM25与IGF2BP3存在相互作用

7 过表达TRIM25使IGF2BP3的泛素化程度增加

当过表达TRIM25时，与未过表达TRIM25的对照组相比，免疫沉淀后的IGF2BP3多聚泛素化链明显增加，而未过表达UB的阴性对照却无此种现象，见图9。这表明过表达TRIM25会使IGF2BP3的泛素化程度增加。

Figure 9. Over-expression of TRIM25 increased the degree of ubiquitination of IGF2BP3.
图9 过表达TRIM25会使IGF2BP3的泛素化程度增加

讨 论

泛素化过程中，泛素分子介导的信号传导经常在癌细胞中改变。几种肿瘤抑制因子和癌基因与泛素-蛋白酶体途径的相关酶存在相互作用，并在泛素缀合和解偶联中起作用[7]。越来越多的证据表明，泛素-蛋白酶体系统在肿瘤的发展中起着重要作用。在本研究中，IGF2BP3能被泛素分子修饰，并且经UPS降解。

含有三联基序的TRIM25也被称为雌激素反应锌指蛋白，是TRIM蛋白家族的成员[8]。TRIM25含有RING指结构域，2个B-box结构域和1个卷曲螺旋结构域，并起到泛素E3连接酶的作用[9]。已经在TRIM25基因的3’非编码区鉴定出雌激素反应元件，且其表达由雌激素诱导[10]。据报道，TRIM25在乳腺癌和卵巢癌中过表达。但在子宫内膜癌中，TRIM25表达下调[11-13]。在本研究中，当过表达TRIM25时，食管癌细胞的增殖受到抑制，而沉默TRIM25后，食管癌细胞的增殖和活力受到明显促进。TRIM25在某些肿瘤中低表达而在另一些肿瘤中又是高表达，提示肿瘤中的TRIM25是一种双向调节泛素E3连接酶。

RNA结合蛋白参与RNA成熟，RNA转换，蛋白质翻译，整个细胞中转录物的移动等多个方面[14]。IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3属于RNA结合蛋白的保守家族[15]。编码IGF2BP3的基因最初被鉴定为编码含有KH结构域的RNA结合蛋白的基因。IGF2BP3不存在于正常胰腺组织、胰腺良性病变或慢性胰腺炎中[16]，但是该蛋白在胰腺导管腺癌中过表达。IGF2BP3能结合mRNA的3’非编码区来防止HeLa细胞中CD44 mRNA的降解[17]。 IGF2BP3还可受IGF2的转录后调节并通过PI3K/MAPK通路来诱导细胞增殖和侵袭[18-19]。在本研究中，过表达IGF2BP3可促进食管癌EC109细胞的活力，而敲减IGF2BP3表达使食管癌EC109细胞的活力受抑制；但敲减IGF2BP3表达的同时过表达TRIM25不会改变食管癌EC109细胞的活力；当过表达TRIM25时，IGF2BP3的表达量减少，但是用蛋白酶体抑制剂MG132处理可避免此效应的产生；并且TRIM25与IGF2BP3存在相互作用。与此同时，过表达TRIM25增加IGF2BP3的泛素化程度。基于此，推测在食管癌细胞中，TRIM25通过泛素化修饰IGF2BP3后，IGF2BP3被蛋白酶体识别并被降解，细胞中IGF2BP3的蛋白水平减少，PI3K/MAPK通路受到抑制，进而最后影响食管癌细胞的活力。本研究发现，IGF2BP3能够被泛素蛋白酶体系统降解。泛素与目的蛋白的共价结合主要存在K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63共7种形式，其中，泛素与目的蛋白通过K48的结合会被泛素蛋白酶体系统降解[20],提示TRIM25至少会对IGF2BP3进行K48的泛素化修饰。

虽然本文就TRIM25、IGF2BP3表达与食管癌EC109细胞活力关系作出阐释，但受研究时间和工作量的限制，本文未对TRIM25及IGF2BP3在食管癌瘤组织或细胞中的表达模式进行深入研究。下一步，我们拟扩大实验规模，分析在TRIM25泛素化IGF2BP3使其被蛋白酶体降解以此抑制EC109细胞活力过程中的分子机制。

综上所述，TRIM25泛素化IGF2BP3使其被蛋白酶体降解，由此抑制食管癌EC109细胞的活力。