尼古丁通过调节巨噬细胞极化加重实验性脉络膜新生血管的形成*

巩亚军，赖坤贝，李龙辉，黄创新，许发宝，周立军，金陈进

(中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室， 广东 广州 510060)

年龄相关性黄斑变性(age-related macular dege-neration, AMD)是发达国家60岁以上人群中首要的不可逆性致盲眼病,AMD导致中心视力下降甚至失明而严重影响患者的生活质量，给家庭和社会造成了极大的经济负担[1-2]。晚期AMD一般分为地图样萎缩和新生血管性或湿性AMD，脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是湿性AMD的典型特征[3]。AMD是基因和环境共同作用的多因素疾病，在众多危险因素中，吸烟被认为是最重要的可修正因素，而尼古丁是香烟中最重要的有害生物活性物质[4-5]。动物实验和临床研究均证实香烟中的尼古丁可加重CNV病情[6-7]，而且吸烟对CNV病情的有害作用即使在戒烟后仍可持续将近20年[8]。令人遗憾的是，吸烟加重CNV病情的原因至今不明，因此目前临床上无任何手段能有效阻止吸烟患者CNV 病情的恶化。而我国吸烟人数众多，由吸烟导致CNV患者病情恶化的情况不容忽视，迫切需要将吸烟加重CNV病情的机制进行详细研究。

湿性AMD的病理过程以多种细胞的增殖和(或)浸润为特点，包括视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞和成纤维细胞[9],而巨噬细胞被认为是AMD病灶中最重要的炎症浸润细胞，在CNV的发展中具有重要的作用[10],但巨噬细胞在尼古丁加重CNV的过程中发挥着何种作用迄今未知。因此，本实验通过尼古丁暴露的激光诱导小鼠CNV模型探究巨噬细胞在尼古丁加重CNV中所发挥的重要作用及其机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1实验动物 C57BL/6J小鼠74只，6～8周，雄性，SPF级，购自广东省医学实验动物中心(合格证号： No.44007200044340; No.44007200046721; No.44007200050429; No.44007200048117)，实验动物的饲养条件及使用遵循国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。

1.2主要试剂及仪器 尼古丁、TRIzol和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-labeled dextran,FITC-dextran)均购自Sigma;荧光素钠注射液(广州白云山明兴制药公司);大鼠抗小鼠F4/80抗体(Bio-Rad);兔抗小鼠诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抗体、山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗大鼠Ⅱ抗(CST);兔抗小鼠CD206抗体(Abcam);VECTASHIELD®Mounting Medium水溶性封片剂(H-1000，VECTOR);实时荧光定量PCR试剂盒和反转录试剂盒(大连宝生物公司);引物(Thermo Fisher);白细胞介素6(interleukin-6，IL-6) ELISA Kit、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA Kit、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)ELISA Kit和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA Kit (R&D);PMSF和RIPA(CST)。810红外半导体激光器(IRIDEX);裂隙灯显微镜(Zeiss);小鼠角膜接触镜(Ocular);MicronⅢ小鼠视网膜成像系统(Phoenix Research);冰冻切片机(Lecia);酶标仪(Bio-tex);荧光定量PCR仪(Roche);荧光显微镜(OLYMPUS)；激光共聚焦显微镜(Zeiss)。

2 方法

2.1实验分组及处理 6～8周的C57BL/6J小鼠由广东省医学实验动物中心购进后，随机分为实验组和对照组，每组小鼠均给予相同体积的饮用水，但实验组饮水中按100 mg/L的剂量加入尼古丁。为保证饮水的新鲜，每天更换。饲养4周后采用激光光凝建立CNV小鼠模型。本实验经中山大学中山眼科中心动物伦理委员会的批准(2016-106)，实验中严格遵循动物福利和伦理准则。

2.2小鼠脉络膜新生血管激光诱导模型的建立 尼古丁或水饲养4周后采用激光诱导脉络膜新生血管模型，具体操作流程如下:复方托吡酰胺充分散瞳，4.3%的水合氯醛经腹腔注射麻醉小鼠(10 mL/kg)，充分麻醉后盐酸丙美卡因点眼以降低角膜敏感性，2%的羟甲基纤维素作为耦合剂，用810红外半导体激光器造模(激光参数：50 μm，50 ms，250 mW)，在距离视乳头2PD处3、6、9及12 钟点行视网膜光凝，光凝后以能看见有白色气泡产生提示Bruch’s膜被击穿为标准，4点均符合此标准者才入选为研究对象，光凝处视网膜出血者排除。造模结束后双眼涂妥布霉素眼膏，置于保温毯复苏后放回饲养间。

2.3小鼠眼底血管荧光造影检测渗漏程度 造模7 d后行荧光素眼底血管造影术(fluorescein fundus angiography，FFA)，复方托吡酰胺散瞳，4.3%的水合氯醛经腹腔注射麻醉小鼠(10 mL/kg)，充分麻醉后盐酸丙美卡因点眼，修剪小鼠胡须，滴2%的羟甲基纤维素于目标眼，用视网膜成像系统拍摄小鼠眼底彩照，观察激光斑是否存在。1%的荧光素钠，按照10 mL/kg的剂量腹腔注射，观察小鼠早期(1 min)和晚期(5 min)的荧光素钠渗漏情况，采用Krzystolik等[11]的方法将激光斑按荧光素渗漏程度分为4级：1级，无渗漏，光斑无高荧光；2级，轻度渗漏，光斑有高荧光但无荧光素渗漏；3级，中度渗漏，光斑高荧光，伴有轻度荧光素渗漏，但渗漏不超过光斑边界；4级，重度渗漏，光斑高荧光，伴有显著荧光素渗漏，且渗漏超过光斑边界。结束后双眼涂妥布霉素眼膏，置于保温毯复苏后放回饲养间。

2.4脉络膜铺片测量小鼠CNV面积大小 造模后第7天，4.3%水合氯醛(10 mL/kg)充分麻醉小鼠，用大头针将小鼠四肢固定在泡沫板，从腹中部剪开腹腔直至剑突下，剪开横膈，血管钳夹住胸主动脉。暴露心脏，剪开右心耳，将1 mL的FITC-dextran溶液(使用前用PBS配成50 g/L)从左心室快速注入。灌注成功的标志为小鼠舌头及四肢变黄，手术显微镜下可见视网膜的血管被黄绿色荧光素充盈。摘除灌注成功的小鼠眼球，4%多聚甲醛固定2 h。手术显微镜下剔除肌肉纤维组织，从赤道部剪开眼球，去除前节，小心将玻璃体视网膜神经上皮层剥离，剩余RPE-脉络膜-巩膜组织，用角膜剪从赤道部到视乳头放射状剪开5～6刀(避开激光斑)，将RPE-脉络膜-巩膜复合体平铺在载玻片上，滴加VECTASHIELD@Mounting Medium水溶性封片剂，加盖玻片，荧光显微镜下拍摄CNV图片，ImageJ软件(版本号1.52a)测量CNV的面积。

2.5免疫荧光观察巨噬细胞时间和空间分布 各组分别于造模后1、3、7和14 d检测CNV 病灶处M1和M2型巨噬细胞，在上述时点取小鼠眼球经固定、梯度脱水、包埋后行冰冻切片，厚度6 μm，选取脉络膜新生血管病灶最大处切片行荧光染色，将F4/80分别与iNOS、CD206共染，经打孔、封闭、孵育Ⅰ和Ⅱ抗，复染核后滴加抗淬灭剂加盖玻片，在荧光显微镜/共聚焦显微镜下观察M1和M2 巨噬细胞的时空分布，计数20倍镜下CNV病灶周围M1和M2型巨噬细胞，计算M2/M1比例。

2.6RT-qPCR检测M1、M2型巨噬细胞极化相关分子标志物 各组分别于造模后第3天摘取眼球，3只眼球为一组，显微镜下冰上操作小心去除结缔组织和肌肉，去除前节，分离RPE-脉络膜-巩膜组织，加入1 mL TRIzol，超声波充分破碎组织后，提取总RNA。总RNA逆转录合成cDNA，以其为模板进行RT-qPCR。各基因特异引物序列见表1。反应条件：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，57 ℃退火及延伸30 s，循环40次。熔解曲线温度65～95 ℃。以β-actin为内参照，对各个基因相对表达量进行计算。

2.7ELISA检测病灶局部炎症因子及VEGF的改变 各组分别于造模后第1和3天摘取眼球，3只眼球为一组，显微镜下冰上操作小心去除结缔组织和肌肉，去除前节，分离RPE-脉络膜-巩膜组织。将组织放入200 μL RIPA与PMSF(100∶1)的混合液中，超声波充分破碎组织后，提取总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度，按照ELISA试剂盒说明测定炎症因子(IL-6、TNF-α和ICAM-1)及VEGF的浓度。

表1 RT-qPCR引物Table 1. Primers of RT-qPCR

3 统计学处理

本研究中定量资料数据以均数±标准差(mean±SD)表示[CNV面积以均数±标准误(mean±SEM)表示]，FFA渗漏程度使用卡方检验，CNV的面积、极化巨噬细胞及炎症因子的改变使用独立样本t检验分析，采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 尼古丁增加CNV的大小和渗漏

造模7 d后FFA结果表明，实验组和对照组的渗漏分数分别为3.31±0.93和2.97±0.94，差异具有统计学意义(2=6.07，P<0.05)，见图1、表2。尼古丁明显加重CNV渗漏程度，相比于对照组(31.25%)，实验组重度渗漏率(56.25%)明显增加(2=4.06，P<0.05)，见表3。造模7 d后，ImageJ软件测量CNV面积，实验组为(17 569.96±1 444.00) μm2，对照组为(10 158.63±711.00) μm2，尼古丁可显著促进CNV的发展(P<0.05)，见图2。

Figure 1. Representative images of laser spot fluorescein leakage. Seven days after laser injury, CNV leakage was imaged with fluorescein fundus angiography. Image were taken at 1 and 5 min after intraperitoneal injection of fluorescein sodium.
图1 激光斑荧光素渗漏代表图片

表2 第7天激光斑荧光素渗漏情况Table 2. Laser spot fluorescein leakage on day 7

2=6.07.*P<0.05vscontrol group.

表3 第7天激光斑荧光素重度渗漏与非重度渗漏情况Table 3. Severe and non-severe leakage of laser spot fluorescein on day 7

2=4.06.*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. Nicotine aggravated CNV in mice. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vscontrol group. Scale bars=50 μm.
图2 尼古丁加重CNV的发展

2 尼古丁增加M2型巨噬细胞的浸润

造模后1、3、7及14 d，F4/80和CD206免疫荧光双染结果表明,M2型巨噬细胞早期出现，逐渐增加，第7天达到高峰，随后缓慢下降，表现为早期低晚期高的时间变化趋势；并且由病灶外围，逐渐向病灶中央浸润，表现出由外到内的空间分布规律，表明尼古丁可明显增加M2型巨噬细胞的浸润,见图3。造模后1、3、7及14 d，F4/80和iNOS免疫荧光双染结果表明，M1型巨噬细胞早期高，第3天为高峰，随后逐渐减少，表现为早期高晚期低的时间变化趋势，见图4。通过计数发现尼古丁主要增加M2型巨噬细胞的浸润，同时升高M2/M1的比率，改变巨噬细胞极化平衡，从而促进CNV的生长(P<0.05)，见图5。

Figure 3. Spatiotemporal expression of M2-type macrophages around CNV lesions. Immunofluorescent F4/80 and CD206 double staining of CNV sections on 1, 3, 7, and 14 d after laser photocoagulation. Green indicates F4/80, red indicates CD206 and blue indicates DAPI-stained cellular nuclei. F4/80+/CD206+M2-type macrophages (white arrows) were detected in CNV sections. Scale bars=20 μm.
图3 CNV病灶周围M2型巨噬细胞的时空表达

Figure 4. Spatiotiemptoral expression of M1-type macrophages around CNV lesions. Immunofluorescent F4/80 and iNOS double staining of CNV sections on 1, 3, 7, and 14 d after laser photocoagulation. Green indicates F4/80, red indicates iNOS and blue indicates DAPI-stained cellular nuclei. F4/80+/ iNOS+M1-type macrophages (white arrows) were detected in CNV sections. Scale bars=20 μm.
图4 CNV病灶周围M1型巨噬细胞的时空表达

Figure 5. Changes of the number and proportion of the macrophages with immunofluorescence staining. Blinded cell counting was performed by two separate observers for each image. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
图5 巨噬细胞个数及比例的变化

3 尼古丁促进巨噬细胞相关分子标志物mRNA的表达

造模后第3天RT-qPCR结果表明，尼古丁组M2相关的分子标志物(Ccl-2、CD163和CD206)mRNA的表达量较对照组显著升高(P<0.05),但是M1相关的分子标志物(Cxcl-10、Cxcl-11和iNOS)mRNA的表达量两组间并无显著差异，见图6。

Figure 6. RT-qPCR analysis for M2-related and M1-related marker mRNA expression in RPE-choroid-sclera complexes 3 d after laser photocoagulation. M2-related markers included Ccl-2, CD163 and CD206; M1-related markers included Cxcl-10, Cxcl-11 and iNOS. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group.
图6 各类巨噬细胞标志物mRNA的表达

4 尼古丁促进炎症因子和VEGF的表达

ELISA结果表明，造模后早期(第1天和第3天)，相对于对照组，尼古丁要明显促进炎症因子和VEGF的表达(P<0.05)，见图7。

Figure 7. Nicotine promoted the secretion of inflammatory factors and VEGF. One and three days after laser injury, the concentrations of inflammatory factors (IL-6, TNF-α and ICAM-1) and VEGF in RPE-choroid-sclera complexes CNV mice were detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
图7 尼古丁促进炎症因子及VEGF的分泌

讨 论

AMD是一个基因和环境共同作用的多因素疾病，许多危险因素包括衰老、家族史、糖尿病、高血压、体重指数、吸烟和饮酒都与AMD的发生和发展密切相关[12]。大量的临床研究表明在众多危险因素中吸烟是最重要的可修正危险因素，香烟中4 000多种有毒物质中，尼古丁被认为是最有力的促血管损伤病理反应物质[5]。一项对4 439居民长达20年的纵向随访研究证实吸烟不仅增高人群中AMD的患病率，而且使晚期CNV的发生率明显上升[13]。Lechanteur等[14]的研究也证实吸烟不仅使AMD患者的发病年龄提前，而且吸烟者发生CNV的几率比不吸烟者高2～4倍，且与年吸烟量密切相关。同时尼古丁可以阻断雷珠单抗(ranibizumab，Lucentis®)抑制CNV的效应，使吸烟的CNV患者抗VEGF疗法的疗效明显降低[15]，这或许从一定程度上解释了为何临床中部分患者对抗VEGF疗法不敏感的原因。目前对尼古丁的病理作用研究主要在促进肿瘤新生血管上，但尼古丁促进CNV的确切机制目前并不清楚。

我们的实验表明尼古丁不仅明显增加了CNV的面积，同时加重CNV的渗漏程度，这与先前的研究结果是一致的[16]。CNV是病理性脉络膜的新生血管长入视网膜下腔，由于新生血管通透性高导致视网膜下出血和渗出物沉积使视细胞变性坏死从而造成90%AMD患者永久性视力丧失[17-18]。脉络膜新生血管的病理机制是血管生成,血管生成是一个复杂的病理过程，包括细胞外基质变性，内皮细胞的迁移、增殖、管腔形成和血管壁的重构，该过程由促新生血管因子和抗新生血管因子的平衡所决定[19]。而尼古丁作为一种天然存在的促新生血管物质，最早在肿瘤和动脉粥样硬化的研究中被发现。Heeschen等[20]发现，尼古丁可以通过血管内皮细胞表面的N型乙酰胆碱受体发挥强效促血管生成作用，从而促进肿瘤生长和动脉粥样硬化的形成。

Pons等[21]的实验表明尼古丁能通过结合色素上皮细胞表面N型乙酰胆碱受体的β1和α4亚基促进VEGF分泌而抑制色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)分泌，上调VEGF/PEDF比率，从而打破促新生血管因子和抗新生血管因子的平衡，加重CNV生长。但添加尼古丁受体阻滞剂后，CNV的生长并没有完全被抑制[16]，这说明尼古丁还通过其它机制促进CNV生长。许建英等[22]的研究结果表明香烟提取物可明显通过NF-κB通路刺激巨噬细胞来源的ICAM-1，后者是巨噬细胞促进新生血管的重要因子。我们的研究表明尼古丁可以增加巨噬细胞的浸润，促进巨噬细胞向M2型极化，从而升高M2/M1的比率。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，局部组织损伤后释放趋化因子，引导外周血中单核细胞向损伤部位聚集，并且活化为巨噬细胞，巨噬细胞具有高度的可塑性，在不同微环境中可分化为功能不同的表型，称为巨噬细胞极化[23]。极化的巨噬细胞在炎症反应、损伤修复、血管生成等病理过程中扮演着重要角色。通常将巨噬细胞分为经典活化型(M1型)和选择活化型(M2型)，二者代表巨噬细胞的两个极端，M1型巨噬细胞抑制血管生成，而M2型巨噬细胞促进新生血管形成，即M2/M1的比例决定新生血管的形成[24]。我们的研究表明尼古丁可以影响巨噬细胞的极化平衡，形成M2High/M1Low的促血管形成模式。此外免疫荧光的结果提示，CNV病灶中M2型巨噬细胞早期就已出现，并且缓慢上升，直至第7天达到高峰，第7～14天则恢复至基线水平。这与激光诱导小鼠CNV在第3天开始出现，第7天明显生长相符合，提示M2型巨噬细胞在CNV的整个发展过程中发挥作用，并在中晚期CNV的持续发展中发挥重要作用，这与Yang等[3]的研究结果一致。

巨噬细胞促进新生血管是通过VEGF、ICAM-1和TNF-α等一系列细胞因子实现的[25]。RPE细胞的损伤在CNV的发病过程中发挥重要作用，损伤的RPE细胞可以分泌前列腺素E2诱导巨噬细胞移行，并分化为M2型巨噬细胞。活化的M2型巨噬细胞可影响内皮细胞、RPE细胞产生ICAM-1、TNF-α和VEGF等细胞因子，改变病灶局部的炎症微环境，进一步促进血源性巨噬细胞的移行浸润，形成恶性循环，而内皮细胞、RPE细胞为中后期VEGF的主要来源细胞，促进CNV中后期的发展。ICAM-1高表达于血管内皮细胞和RPE细胞表面，是细胞识别的重要分子，介导巨噬细胞的粘附与移行[26]。TNF-α具有调节炎症、增殖、细胞毒性的多种作用，可以促进VEGF和单核细胞趋化蛋白-1等促血管生成因子的表达[27]，而我们的实验表明尼古丁通过增加M2型巨噬细胞的浸润，促进ICAM-1和TNF-α等的炎症因子分泌，这说明尼古丁可以通过调控巨噬细胞极化而增加ICAM-1和TNF-α等炎症因子的分泌，从而改变病灶周围炎症微环境，增加VEGF的分泌。活化的M2型巨噬细胞是早期VEGF的重要来源，并且通过分泌IL-8和IL-10等细胞因子作用于RPE细胞和血管内皮细胞，促进其产生更多的VEGF，推动中晚期CNV的发展[28-29]。我们的实验通过ELISA检测激光后早期(第1、3天)CNV病灶周围的VEGF蛋白水平，发现尼古丁刺激可以明显增加早期VEGF的分泌，我们推测尼古丁刺激早期激光斑周围浸润的血源性巨噬细胞向M2型极化，促使早期VEGF的分泌增加，促进CNV早期的生长。

综上所述，我们的实验表明了尼古丁能够通过促进M2型巨噬细胞的极化，形成M2High/M1Low的促新生血管形成模式，进而上调炎症因子(IL-6、TNF-α和ICAM-1)及VEGF的表达和翻译，最终加重激光诱导小鼠CNV的发展。我们的研究结果提示巨噬细胞极化介导的炎症在CNV的发展中发挥重要作用，这在一定程度上解释了临床吸烟的AMD患者单纯抗VEGF疗法不敏感的原因，也为这类患者的治疗提供了新思路和新策略。巨噬细胞极化发生在CNV早期，调控巨噬细胞极化有望从源头控制促血管生成因子的表达及由此触发的CNV，为针对巨噬细胞的靶向治疗提供理论依据。但是小鼠CNV模型的病理过程与人类AMD并不完全相同，因此，还需进一步在人体中验证该机制的确切性。