circRNA_001131通过结合miR-25-3p抑制心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达*

潘 蓉，杨 静，张 铭，朱杰宁，袁淑菁，李 晖，杨 莹，严钰敏，符永恒，单志新, △

(华南理工大学 1生物科学与工程学院， 2医学院， 广东 广州 510006； 3广东省心血管病研究所， 广东省人民医院， 广东省医学科学院, 广东 广州 510080)

心肌纤维化主要表现为心肌组织中大量的细胞外基质(extracellular malrix, ECM)沉积，是多种心脏疾病的重要病理特征[1]，纤维化心肌僵硬度增加，导致心脏的收缩和舒张功能异常[2]，引起恶性心律失常[3]、心肌损伤[4]、心力衰竭甚至心脏性猝死。心肌纤维化来自心肌肌成纤维细胞样细胞的形成和活化，能够从头合成应力纤维、胶原蛋白(I型胶原蛋白和III型胶原蛋白)和ECM蛋白，参与心肌重构过程。目前，心肌纤维化的发生机制尚未完全阐明，尚无非常有效的临床干预手段。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种内源性的非编码RNA，可能与多种疾病的发生相关[5]。circRNA是由mRNA前体(mRNA precursor)转录本通过反向剪接而成的闭合环状的非编码RNA，由于具有环状闭合结构，不易受核酸外切酶的影响，在细胞内更稳定。自1976年Sanger等[6]发现circRNA以来，关于circRNA生物合成和功能的研究不断深入。circRNA具有多种生物学功能，如海绵吸附微小RNA(microRNA，miRNA，miR)、海绵吸附蛋白及调节宿主基因转录和翻译蛋白等[7]。已有研究发现circRNAs参与多种心血管疾病的发生发展过程[8]，例如CDR1as在心肌梗死小鼠心肌中表达上调，并通过靶向吸附miR-7而增加其下游靶基因PARP和SP1的表达，进而加重心肌梗死的损害作用[9]；miR-223转基因小鼠会发生心肌肥厚和心力衰竭，ARC是miR-223的下游靶基因，而环状RNA HRCR可内源性吸附miR-223来增加ARC表达，进而发挥抑制心肌肥厚的作用[10]。

本文将关注腹主动脉缩窄(abdominal aortic coarctation，AAC)手术诱导的心肌纤维化大鼠心肌中差异表达变化的circRNAs，并研究其中表达增强的circRNA_001131对心肌纤维化的调控作用。circRNA_001131来自于宿主基因第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,Pten)，Pten蛋白具有抑制心肌纤维化的作用[11]，但circRNA_001131对心肌纤维化相关基因表达的调控作用尚不清楚。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级Sprague-Dawley(SD)乳大鼠，雌雄不限，1～3 d，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2016-0041。

2 主要试剂

DMEM/F12细胞培养基购自HyClone；特级澳洲胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶购自Gibco；ribonuclease R (RNase R)购自广州吉赛生物；放线菌素D购自生工有限公司；细胞核/细胞质RNA提取试剂盒购自Norgen Biotek；TRIzol和逆转录试剂盒购自Invitrogen；SYBR Green Mix购自TaKaRa；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海碧云天；抗GAPDH抗体和抗Col3a1抗体购自Protein Technology;抗Col1a1抗体购自Thermo;抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗体购自Abcam；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo；ECL发光液购自Millipore；PVDF膜购自Whatman；引物均来自Invitrogen，见表1；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

表1 PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

F: forward; R: reverse.

3 主要方法

3.1大鼠腹主动脉缩窄模型制备 用数字标签随机分组法，将20只雄性SD大鼠分为假手术组和模型组，每组各10只动物。将手术器械术前高压灭菌，用氯胺酮(4 mg/kg)合用地西泮(40 mg/kg)麻醉大鼠，于腿部肌注，待其麻醉后，先用剃毛剪将腹部毛剪净，再涂抹脱毛剂，湿布擦除干净，完全暴露腹部皮肤，保证术中大鼠呼吸通畅。沿腹白线剪开皮肤，剖开腹部肌肉，轻轻将胃肠按顺序取出，置于无菌纱布上，暴露腹主动脉，剪开肌膜，钝性分离左右两肾动脉分支间的腹主动脉区域，期间应用生理盐水保持大鼠内部脏器湿润。暴露腹主动脉并在双肾动脉上方分离腹主动脉，用0.3 mm银夹造成腹主动脉部分狭窄。将各脏器归复原位，用缝合线缝合腹部肌肉和皮肤。用消毒碘伏涂抹伤口处，放在温暖处，于术后前3 d肌注青霉素钠(每天20×105U)。假手术组操作与模型组相同，但只剥离腹主动脉，不使用银夹缩窄。

3.2Masson三色染色 腹腔注射2 mL/kg戊巴比妥麻醉大鼠，取左心室心肌组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋并切成4 μm厚度的连续切片，Masson胶原纤维染色，观察心脏组织的胶原纤维增生情况，分析评价AAC模型大鼠和对照大鼠心肌的纤维化程度。用胶原体积分数(collagen volume fraction，CVF)分析心肌的纤维化程度，选择8个单独的视图(放大率=原始×400)，并使用以下公式评估CVF：CVF(%)=胶原面积/总面积×100%。

3.3circRNAs芯片检测 取AAC手术组和假手术组大鼠心肌组织进行circRNAs表达谱分析,芯片杂交和结果分析由上海康成公司协助完成。简要步骤如下：先用RNase R消化大鼠心肌组织总RNA，去除线性RNA, 富集circRNAs。将富集后的circRNAs 采用随机引物转录、扩增为荧光标记的cRNA探针(Arraystar Super RNA Labeling Kit)。cRNAs 探针与Arraystar Human circRNA Array(8×15K)表达谱芯片上的寡核苷酸片段杂交，AgilentScanner G2505C扫描，Agilent Feature Extraction Software (Version 11.0.1.1)分析杂交结果。

3.4乳大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)的原代分离培养 将出生1～3 d SPF级SD乳大鼠的心肌组织，以0.08%胰蛋白酶和0.08%胶原酶混合液消化，分离CFs。离心弃去上清液，沉淀用完全培养基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM/F12培养基)重悬细胞，培养于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，1.5 h后根据差速贴壁原理分离心肌细胞和CFs，置于培养箱中培养。

3.5circRNA_001131重组腺病毒的构建和包装 根据大鼠circRNA_001131模板DNA序列和腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点序列，设计合成引物，通过PCR扩增得到circRNA_001131 模板的DNA插入片段，按照我们已报道的方法[12]，将circRNA_001131片段定向插入到pAdTrack-CMV载体的多克隆位点。并进一步将pAdTrack-CMV-circRNA_001131与pAdEasy-1在E.ColiBJ5183中进行重组。最后，重组circRNA_001131腺病毒载体用限制性内切酶PacI线性化，转染至293T细胞中，包装重组腺病毒。

3.6细胞处理 用rAd-circRNA_001131感染CFs：取传至第2代(P2)乳大鼠CFs接种于12孔板(每孔细胞密度2×105)，细胞贴壁过夜，分别感染rAd-GFP或rAd-circRNA_001131大约4 h 后，再行含5%胎牛血清的培养基继续培养24 h。用miR-25-3p mimic转染CFs：取1.75 μL脂质体至50 μL DMEM/F12培养基中充分混匀，室温静置5 min；同时将miR-25-3p mimic和scrambled对照分别加至50 μL DMEM/F12培养基中充分混匀，室温静置5 min；再用移液器分别上述2种混合物充分混匀，室温静置20 min；取100 μL miR-25-3p mimic/scrambled脂质体复合物加至细胞孔中(miR-25-3p mimic/scrambled终浓度为100 nmol/L)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，转染24 h后结束实验。

3.7RNase R和放线菌素D实验 将P2乳大鼠CFs接种于6孔板中，贴壁后低血清培养过夜。分别用2 g/L放线菌素D行0、4、8、12和24 h处理后提取细胞总RNA。提取过表达circRNA_001131的大鼠CFs总RNA，用RNase R在37℃孵育0～30 min，70℃孵育10 min使酶灭活，RT-qPCR检测circRNA_001131和其宿主基因Pten的mRNA表达。

3.8RT-qPCR检测circRNA_001131和纤维化相关基因的表达 用TRIzol试剂提取CFs总RNA，取1.0 μg总RNA，加入5×逆转录试剂4 μL，用oligo(dT)15和random primers逆转录出cDNA，用于检测circRNA_001131和纤维化相关基因的mRNA表达水平，分别以U6和GAPDH作为检测内参照。在ViiA 7 Quantitative PCR System (Applied Biosystems)进行PCR和结果分析。以2-ΔΔCt法计算circRNA_001131和纤维化标志物的相对表达水平。

3.9Western blot法检测蛋白水平 处理后的大鼠CFs加入蛋白裂解液RIPA，冰上裂解，吸取裂解液后4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清进行蛋白质定量、分装，加入4×上样缓冲液，100 ℃加热10 min使蛋白质变性。然后进行SDS-PAGE，用PVDF膜转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，然后用相应的抗体anti-Col1a1(1∶2 000)、anti-Col3a1(1∶2 000)和anti-α-SMA(1∶3 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3遍，加入相应来源的 II 抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗3遍后用ECL发光试剂盒显影，以GAPDH(1∶5 000)为内参照，扫描灰度值并分析蛋白表达相对含量。

3.10双萤光素酶报告实验验证circRNA_001131与miR-25-3p的结合作用 参照文献方法[13]分别构建包含潜在miR-25-3p结合序列的重组萤光素酶报告质粒pGL3-circRNA_001131及包含结合序列突变的重组质粒pGL3-circ_001131-Mut。将HEK293细胞(细胞密度约为每孔1×105)转染1.5 μg重组萤光素酶报告质粒，100 nmol/L miR-25-3p mimic以及10 ng pRL-TK(表达海肾萤光素酶的内参照质粒)。转染24 h后，测定萤火虫萤光素酶(FL)及海肾萤光素酶(RL)相对活性，FL/RL可反映circRNA_001131与miR-25-3p结合的能力。

4 统计学处理

用SPSS 25.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示，两组间比较采用独立t检验；多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni 校正的t检验进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 circRNA_001131在AAC手术大鼠心肌中表达上调

与假手术组大鼠相比，AAC手术组大鼠心脏外观明显变大，Masson染色显示心肌间质胶原沉积加剧，CVF明显升高(P<0.01),见图1A。circRNA芯片检测结果显示，AAC手术组大鼠心肌中呈2倍以上上调或下调表达的circRNAs分别有126和187个,见图1B。RT-qPCR证实，与对照组相比，AAC手术组大鼠心肌中circRNA_001131和其宿主基因Pten表达均显著升高(P<0.01),见图1C。DNA测序列结果证实PCR产物中包含的circRNA_001131特异性接头序列正确,见图1D、E。

Figure 1. circRNA_001131 expression in the myocardium of rat ACC model. A: Masson trichrome staining (scale bar=100 μm); B: the scatter plot figure showed the representative up- or down-regulated circRNAs in the myocardium of rat AAC model; C: the expression of circRNA_001131 and Pten mRNA in the myocardium of rat AAC model detected by RT-qPCR; D: schematic diagram of the source of circRNA_001131; E: PCR product of circRNA_001131 was identified by 1.2% agarose gelelectrophoresis and DNA sequencing assay. M: DL2000 DNA marker (from up to down, 2 000, 1 000, 750, 500, 250 and 100 bp); Lane 1: cDNA of rat myocardium; Lane 2: rat genomic DNA. Mean±SEM.n=5～8.*P<0.05,**P<0.01vssham group.
图1 circRNA_001131在AAC模型大鼠心肌中的表达

2 circRNA_001131在血管紧张素II(angiotensin-II, Ang-II)处理的大鼠CFs中表达上调

我们用10 μmol/L Ang-II处理乳大鼠CFs，RT-qPCR结果显示纤维化相关基因Col1a1、Col3a1和Acta2(编码α-SMA)，circRNA_001131及其宿主基因Pten表达显著增加(P<0.05),见图2A；核质RNA分离和RT-qPCR实验结果显示，circRNA_001131主要存在于大鼠CFs的胞质中，而GAPDH和U6分别在胞质和胞核中富集存在,见图2B。RT-qPCR结果显示，用放线菌素D和RNase R处理后，Pten的mRNA水平显著降低，而circRNA_001131降低不明显，说明大鼠CFs中circRNA_001131有较好的稳定性，见图2C、D。

Figure 2. Identifications of expression, distribution and stability of circRNA_001131 in 10 μmol/L Ang-II-treated rat CFs. A: the expression of Col1a1, Col3a1, Acta2, circRNA_001131 and Pten in Ang-II-induced rat CFs detected by RT-qPCR; B: the distribution of circRNA_001131, GAPDH and U6 in rat CFs; C: RT-qPCR analysis of circRNA_001131 and Pten expression in rat CFs exposed to actinomycin D; D: RT-qPCR analysis of circRNA_001131 and Pten mRNA level post RNase R treatment. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsPten;△P<0.05vsmock group.
图2 circRNA_001131在AngⅡ处理的大鼠CFs中的表达、分布和稳定性的鉴定

3 circRNA_001131抑制大鼠CFs中纤维化相关基因表达

利用构建的重组circRNA_001131的腺病毒(rAd-circRNA_001131)感染P2乳大鼠CFs，24 h 后荧光倒置显微镜下观察，rAd-circRNA_001131共表达的绿色荧光蛋白水平显示腺病毒感染CFs充分，见图3A。RT-qPCR证实circRNA_001131在大鼠CFs中充分过表达(P<0.01)，见图3B;RT-qPCR和Western blot结果显示，在过表达circRNA_001131的大鼠CFs中纤维化相关基因Col1a1和Col3a1表达显著下调(P<0.01)，而Acta2变化不显著,见图3C、D。

4 miR-25-3p可减弱circRNA_001131对心肌纤维化的抑制作用

序列分析提示，circRNA_001131的第218～238碱基可能是miR-25-3p的结合位点，见图4A。双萤光素酶报告基因实验结果显示，miR-25-3p模拟物与pGL3-circRNA_001131质粒共转染HEK293细胞后，萤光素酶活性较对照组显著下降，而共转染pGL3-circRNA_001131-Mut质粒的萤光素酶活性无明显变化，见图4A。利用P2乳大鼠CFs，先行感染rAd-circRNA_001131后再转染100 nmol/L miR-25-3p mimic，24 h后检测纤维化相关基因的表达情况。Western blot结果显示，过表达circRNA_001131的大鼠CFs中Col1a1和Col3a1表达显著降低，转染miR-25-3p可减弱circRNA_001131对Col1a1和Col3a1表达的抑制作用(P<0.01)，见图4B。

Figure 3. The effect of circRNA_001131 on the expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA/Acta2 in rat CFs. A: adenovirus-mediated over-expression (OE) of circRNA_001131 in rat CFs (the infection of the recombinant circRNA_001131 adenovirus was monitored by the co-expressed marker of GFP; scale bar=100 μm); B: the expression of circRNA_001131 was determined by RT-qPCR; C: the mRNA expression of Col1a1, Col3a1 and Acta2 in CFs was detected by RT-qPCR; D: the protein expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA in CFs was determined by Western-blot. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsvector group.
图3 circRNA_001131对大鼠CFs中Col1a1、Col3a1和α-SMA表达的影响

讨 论

近年来，随着RNA测序技术的广泛应用，研究者在不同物种中发现大量的circRNA存在，并具有物种、组织特异性。越来越多的研究表明，circRNA与肿瘤[14]、神经系统疾病[15]和心血管疾病[16]的发生密切相关。研究发现，circHIPK3在AngⅡ处理的成纤维细胞和心肌组织中表达上调，抑制circHIPK3可减少对miR-29b-3p的吸附作用而抑制成纤维细胞增殖、迁移及纤维化相关基因的表达[17]。我们既往证实circRNA_000203在糖尿病小鼠心肌中高表达，它可以通过特异结合miR-26b-5p，促进Col1a2和Ctgf的表达来发挥促心肌纤维化作用[18-19]。

本文发现，在AAC诱导的大鼠心肌纤维化模型中，circRNAs表达谱出现显著的差异变化，提示circRNAs可能参与了心肌纤维化的发生过程。环状RNA是不具有5’端帽子和3’端polyA尾的环状非编码RNA，更加耐受核酸内切酶，因而较线形mRNA更稳定[20]。我们的结果显示，在利用放线菌素D处理后，线性Pten mRNA随时间延长降解增多，而circRNA_001131无明显变化。当用RNase R处理时后，Pten mRNA水平显著下降，而circRNA_001131降解不明显。上述结果说明circRNA_0011311有很好的细胞稳定性，符合环形RNA的特征。

Figure 4. miR-25-3p reversed the inhibitory effect of circRNA_001131 on the expression of fibrosis-associated genes in CFs. A: verification of miR-25-3p as a target gene of circRNA_001131 by dual-luciferase reporter assay; B: the protein expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA in CFs was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspGL3-promoter group;△P<0.05,△△P<0.01vsvector group;#P<0.05,##P<0.01vsOE-circRNA_001131 group.
图4 miR-25-3p可以减弱circRNA_001131对心肌纤维化的抑制作用

我们发现过表达circRNA_001131后的CFs中Col1a1和Col3a1表达下调，提示circRNA_001131与其宿主基因Pten均具有抑制心肌纤维化的作用。过表达circRNA_001131不影响CFs中Acta2表达，提示circRNA_001131不影响CFs向肌成纤维细胞的转化过程。鉴于circRNA_001131主要存在于CFs的胞质中，胞质中的circRNA可能通过吸附特异的蛋白、吸附miRNAs和翻译成蛋白/多肽等方式发挥生物学功能[7]，例如circPABPN1可吸附RNA结合蛋白HuR而抑制HuR与多腺苷酸结合蛋白核1(polyadenylate-binding protein nuclear 1,PABPN1)的结合，进而抑制PABPN1的翻译而抑制细胞增殖[21]。circ-ZNF609含有一个753个碱基的开放阅读框，可以翻译出蛋白来调控心肌生成[22]。本文从circRNA_001131可能通过特异结合某些miRNAs的途径来探究其发挥抑制心肌纤维化作用机制。生物信息学分析结果提示，miR-25-3p与circRNA_001131上存在结合位点，双萤光素酶报告基因实验验证了miR-25-3p与circRNA_001131间的结合作用。功能实验进一步证实，转染miR-25-3p可以特异地减弱circRNA_001131对心肌纤维化的抑制作用，上述结果表明circRNA_001131可通过结合miR-25-3p发挥抑制CFs中Col1a1和Col3a1表达的作用，但参与介导circRNA_001131发挥抑制心肌纤维化作用的miR-25-3p靶基因尚待进一步确认。我们证实circRNA_001131与miR-25-3p只有一个结合位点，并参与介导circRNA_001131抑制心肌纤维化的作用，但不排除circRNA_001131也可以结合其它的miRNAs或RNA结合蛋白来介导其生物学功能。

综上所述，我们发现circRNA_001131在AAC诱导纤维化的大鼠心肌和Ang-II处理的大鼠CFs中表达上调。在CFs中过表达circRNA_001131后，纤维化相关基因Col1a1和Col3a1表达下调，而miR-25-3p可减弱circRNA_001131抑制心肌纤维化的作用。本文明确了circRNA_001131通过结合miR-25-3p发挥抑制心肌纤维化的作用，但其下游作用靶基因还有待于进一步探究。