COL1A1 敲除抑制卵巢癌细胞 ES-2 增殖*

钱若文轩，杨柳青，石子晴，陈子彦，胡汉寅，邹尚朴，朱恒延，潘巍巍

(嘉兴学院医学院生物教研室， 浙江 嘉兴 314001)

I型胶原蛋白α1链(collagen type I alpha 1 chain, COL1A1)，由COL1A1基因编码，它可以构成胶原纤维，同时也作为骨髓的有效成分，参与细胞增殖、浸润、转移和血管生成，并且与多种类型肿瘤有关[1-3]。研究表明，在以I型胶原蛋白为支架材料进行人卵巢癌细胞HO-8910 PM体外三维培养时，细胞在I型胶原蛋白基质大部分存活，并且能够募集成簇，正常生长，通过观察I型胶原蛋白基质中细胞的形态、活力和增殖情况，表明I型胶原蛋白所形成的黏性交叉网络状结构能够充分支持卵巢癌细胞的生长[4]。Ⅰ型胶原蛋白基因缺乏可促进乳腺癌细胞转移[5]，在脑肿瘤中Ⅰ型胶原蛋白是肿瘤微环境的重要成分[6]。Want3a/β-catenin通路中MRTF-A沉默可降低乙酰化组蛋白H3K9和RNA聚合酶在COL1A1启动子上结合，减少COL1A1的表达，而转录因子osterix能够直接与COL1A1的启动子相结合，上调COL1A1表达量[7]。

在本研究中，我们通过CRISRP/Cas9技术构建COL1A1基因敲除的人卵巢癌ES-2细胞，通过细胞增殖、克隆形成和细胞迁移研究COL1A1缺失在卵巢癌中的作用，为进一步筛选卵巢癌治疗的分子靶标提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

TaKaRa 高保真酶、5×Buffer、T4 DNA连接酶、氨苄青霉素、cDNA逆转录试剂盒和qPCR试剂盒均购自大连宝生物公司；T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)和BbsI购自NEB；DL10000 DNA Marker、PCR产物回收试剂盒、 DNA胶回收纯化试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Axygen BioSciences； Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen； DH5α感受态细胞由本实验室保存； Polybrene购自Sigma； PolyJetTM转染试剂购自SignaGen； FBS购自Gibco；DMEM/FI2 和RPIM-1640细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和青链霉素购自HyClone；TRIzol均购自Invitrogen； β-actin抗体购自Cell Signaling Technology; COL1A1抗体购自Santa Cruz;各种II抗购自 Jackson Labs。PX459质粒由美国加州大学圣地亚哥分校管坤良教授赠送。

2 动物和细胞

ES-2卵巢癌细胞由购自中科院上海细胞所。 ES-2细胞使用DMEM/F12细胞培养液(含有10% FBS和1%青链霉素)，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。细胞1 ∶ 3的比例传代，每1～2 d换液以供后继实验使用。6～8周龄BALB/c 雌性裸鼠，SPF级，体重20～30 g，10只购自浙江省实验动物中心(合格证编号为20130016009052)，裸鼠饲养在嘉兴学院医学院实验动物中心，SPF级。

3 主要方法

3.1脂质体转染和COL1A1敲除的卵巢癌细胞筛选COL1A1基因的sgRNA序列连接参照文献[8]。COL1A1-1: GACGGGACAGCACTCGCCCT;COL1A1-2: GCAGGAGATTACCTCGACGC。1×105个卵巢癌ES-2细胞接种于6孔板，使用Lipofectamine 3000转染试剂将构建好的PX459空载体、PX459-COL1A1-1和 PX459-COL1A1-2质粒转染到ES-2细胞。转染 8 h后给细胞换成正常培养液。24 h后给细胞加嘌呤霉素(2 mg/L)筛选 3 d， 获得稳定敲除COL1A1基因的细胞系。

3.2细胞计数 血细胞计数板计数，每孔分别取1×105个对照细胞(WT)与COL1A1基因敲除的卵巢癌细胞ES-2(COL1A1 KO)接种于6孔板过夜培养，换成新鲜培养液或无血清培养液连续3 d计数，每天计数前用倒置荧光显微镜拍照。

3.3TRIzol法提取细胞总RNA和定量PCR 卵巢癌细胞用TRIzol法提取细胞总RNA，过程详见试剂说明，使用核酸定量分析仪测 RNA浓度。逆转录过程如下：65 ℃保温5 min，冰上迅速冷却，98 ℃ 10 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，45个循环。将cDNA以1 ∶5比例用DEPC水稀释，对照组cDNA和实验组cDNA用以实时荧光定量PCR检测，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1. The sequences of the primers

MMP-13: matrix metalloproteinase-13; TIMP-1: tissue inhibitor of metalloproteinase-1; BMP2: bone morphogenetic protein 2.

3.4Western blo实验 将对照细胞与COL1A1敲除的卵巢癌ES-2细胞过夜培养，计数，分别收集5×105个对照细胞与COL1A1敲除的卵巢癌细胞于1.5 mL的离心管中，收集细胞，提取细胞总蛋白，取100 μg总蛋白做SDS-PAGE，转至PVDF膜上， 5%脱脂奶粉中封闭过夜, TBST洗膜3次， 每次10 min，与抗β-actin和COL1A1抗体4℃孵育过液，TBST洗膜3次， 每次10 min，加入II抗孵育TBST洗膜3次， 每次10 min，杂交反应后应用ECL Western blot化学发光试剂盒暗房显影。

3.5PI-Annexin V染色检测细胞凋亡 将对照细胞与COL1A1敲除的卵巢癌细胞ES-2过夜培养，计数，分别收集1×106个细胞于15 mL的离心管中，用预冷1×PBS补足至2 mL， 离心5 min弃上清，再用预冷的2 mL 1×PBS洗涤2次,用1 mL 1× binding buffer重悬细胞，取1×105个细胞(即100 μL液体)放置到1.5 mL 离心管中， PI-Annexin V染色按照试剂盒说明操作，设置对照，室温避光放置15 min, 用流式细胞术检测细胞凋亡。

3.6软琼脂集落形成实验 配制0.5%下层胶，取1.5 mL混合液于6孔板，配制底层胶，室温静置15 min待胶凝固。将对照细胞与COL1A1 KO的细胞用培养液将细胞吹打成单细胞悬液，血细胞计数板计数，与 0.35%顶层胶混合，接种于6孔板，细胞数为每孔2 500。室温静置15 min待胶凝固，在上层放入 2 mL新鲜DMEM培养液，37 ℃，5% CO2培养14～20 d，用台盼蓝染色后计算集落数(每个集落的细胞数目大于50), 每组设3个重复，实验重复3次。

3.7细胞划痕实验 将对照细胞与COL1A1基因敲除的卵巢癌细胞ES-2接种于6孔板过夜培养，待细胞密度达到 80%用200 μL吸头在细胞表面划过，使细胞形成划痕，给细胞换成无血清培养液，分别在0 h、10 h和20 h在同一位置照相,观察细胞的迁移。

3.8免疫荧光 分别取1×105个对照细胞与COL1A1基因敲除的ES-2细胞,接种于放置玻片的24孔板，细胞过夜培养，PBS洗1次，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次，用含5%BSA的PBST封闭液室温封闭1 h, 弃封闭液加入 p-histone H3、p-H2AX、cleaved caspase-3和Ki-67 I抗(1 ∶200)室温1 h，PBS洗3次， 加入150 μL II抗，室温避光孵育1 h，DAPI 复染5 min，PBS洗3遍，封片，观察。

3.9PI染色检测细胞周期 分别收集1×106个WT和COL1A1基因敲除ES-2细胞于1.5 mL离心管中，离心去上清，加入1 mL预冷的PBS洗涤，离心，去上清，再加入300 μL预冷的PBS，重悬细胞。再将重悬液缓慢滴入700 μL预冷的无水乙醇中，固定过夜。第2天将1.5 mL的固定液转移至15 mL离心管中，补加2 mL PBST，离心去上清。用2 mL预冷的PBST缓慢重悬细胞，离心去上清，操作同上一步，2次。用500 μL染色液重悬细胞，转移至1.5 mL离心管中，避光30～60 min,用流式细胞仪检测细胞周期。

3.10裸鼠荷瘤模型 6～8周龄BALB/c 雌性裸鼠，SPF级，体重20～30 g，共10只，分成2组，每组5只。在无菌条件下，每只裸鼠两侧各注射5×105个细胞，第1组注射WT ES-2细胞,第2组注射COL1A1基因敲除ES-2细胞。1周后用游标卡尺测量肿瘤大小，待肿瘤直径≥15 mm，深度麻醉后处死小鼠取肿瘤并称重。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism统计软件统计分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 COL1A1敲除抑制卵巢癌ES-2细胞增殖、集落形成和迁移

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人卵巢癌ES-2细胞中COL1A1基因，如图1A所示，ES-2细胞中COL1A1基因出现了大片段碱基顺序紊乱；Western blot结果显示COL1A1基因敲除组COL1A1蛋白表达量显著降低,见图1B。这些结果表明我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在卵巢癌ES-2细胞中成功敲除COL1A1基因。我们连续3 d对野生型ES-2细胞和COL1A1基因敲除ES-2细胞进行计数，结果显示无论在有血清还是无血清的培养液里ES-2野生型ES-2细胞增殖率均明显高于Col1a1基因敲除ES-2细胞 (P<0.01),见图1C。免疫荧光检测表明在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中增殖相关蛋白Ki-67表达显著降低，见图3B, Western blot检测p-histone H3蛋白的表达量在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中明显增加，见图4B。软琼脂集落形成实验结果显示COL1A1敲除显著抑制细胞集落形成能力(P<0.01)，见图1D。细胞划痕实验结果显示COL1A1敲除抑制了卵巢癌细胞的迁移(P<0.01)，见图1E。

Figure 1.COL1A1gene deletion inhibited the proliferation, colony formation and migration of human ovarian cancer ES-2 cells. A: genomic sequencing ofCOL1A1deletion in ES-2 cells; B: COL1A1 protein expression in ES-2 cells was detected by Wes-tern blot； C： the proliferation of ES-2 cells with or without fetal bovine serum (FBS) was determined by Trypan blue staining; D: the number of colonies formed by ES-2 cells was counted after Trypan blue staining; E: the migration of ES-2 cells was determined by wound-healing assay (×10). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
图1COL1A1基因敲除抑制卵巢癌细胞增殖、集落形成和迁移

2 COL1A1敲除将卵巢癌细胞周期阻滞在G2期

COL1A1敲除的卵巢癌细胞G1和S期细胞减少，G2期细胞显著增加(P<0.01)，见图2A。实时定量PCR检测细胞周期相关基因p53下游基因Noxa和p16的表达在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中显著增加(P<0.01)，见图2B。

Figure 2. Deletion ofCOL1A1affected ES-2 cell cycle. A: the cell cycle was measured by flow cytometry； B: Noxa and p16 mRNA expression was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.
图2COL1A1缺失影响ES-2细胞周期

3 COL1A1敲除促进细胞凋亡和DNA损伤

PI-Annexin V细胞凋亡实验表明COL1A1敲除的卵巢癌细胞凋亡显著增多(P<0.01),见图3A。免疫荧光检测细胞增殖相关蛋白Ki-67在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中低表达，凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和DNA损伤相关蛋白p-H2AX在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中高表达,见图3B。Western blot结果表明COL1A1敲除还促进凋亡相关蛋白cleaved PARP蛋白表达增加,图4B。

Figure 3. Deletion ofCOL1A1promoted apoptosis and DNA damage of ES-2 cells. A: the cell apoptosis was detected by PI-Annexin V staining and flow cytometry; B: immunofluorescence was used to detect the expression and distribution of Ki-67, cleaved caspase-3 and p-H2AX (green). DAPI for DNA (blue). The scar bar=30 μm. *: cleaved caspase-3 staining positive cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
图3COL1A1缺失促进ES-2细胞凋亡和DNA损伤

4 COL1A1敲除通过影响多种分子表达而抑制卵巢癌细胞增殖

RT-qPCR检测结果显示，在COL1A1敲除的细胞中osterix和MMP13的mRNA表达量显著减少(P<0.01)，aggrecanase-1、骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表达量显著增多(P<0.01)，而金属蛋白酶组织抑制物1(tissue inhibitor of metallopro teinase 1, TIMP1)mRNA表达无显著差异(P>0.05); Western blot检测结果表明，COL1A1敲除的细胞中p-ERK1/2和Akt表达量明显增加，见图4。

Figure 4. Effects ofCOL1A1deletion on the expression of various molecules in ES-2 cells. A: the mRNA expression of osterix, MMP-13, aggrecanase-1, aggrecan, TIMP1 and BMP2 was detected by RT-qPCR; B: the protein levels of ERK1/2, p-ERK1/2, p-histone H3, PARP, cleaved PARP and Akt were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
图4COL1A1缺失对多种分子表达的影响

5 COL1A1敲除抑制卵巢癌细胞在裸鼠体内增殖

为了进一步验证COL1A1缺失在体内的作用，给裸鼠分别注射了WT和COL1A1敲除ES-2细胞,并记录裸鼠肿瘤的大小及称重。结果显示，COL1A1敲除在体内明显抑制肿瘤生长，见图5A、B。Western blot结果显示，COL1A1敲除的肿瘤组织中p-ERK1/2表达增加，p-histone H3表达降低(图5C)。RT-qPCR检测结果显示， osterix和MMP-13在COL1A1敲除的肿瘤组织中低表达，而aggrecanase-1在COL1A1敲除的肿瘤中高表达,见图5D。

Figure 5.COL1A1deletion inhibited tumor growth in vivo. The WT andCOL1A1-deficient ES-2 cells (5×105cells per injection) were subcutaneously implanted into nude mice. A: the tumor growth curve; B: the tumor size and weight at the end of the experiment; C: the protein levels of COL1A1, ERK1/2, p-ERK1/2 and p-histone H3 in the tumor with COL1A1 deletion; D: the mRNA expression of MMP-13, osterix and agrecanase-1 was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3～5.**P<0.01vsWT group.
图5COL1A1缺失抑制裸鼠体内肿瘤形成

讨 论

COL1A1基因编码I型胶原的pro-α1链，I型胶原蛋白的三螺旋包含2条α1链和1条α2链[9]。I型胶原蛋白是形成原纤维的胶原蛋白。COL1A1作为原癌基因与肿瘤发生密切相关[10-12]。Mori等[13]研究发现COL1A1在人膀胱癌分化和转移中具有重要作用。Liu等[14]证实COL1A1能够介导乳腺癌转移，可以作为乳腺癌潜在的治疗靶点。此外，COL1A1还作为肝癌发生和发展的一个重要标志物[15]，但COL1A1在卵巢癌中的作用研究较少。

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑方法检测卵巢癌细胞中COL1A1的功能，该基因编辑方法是在引导RNA指导下与目的核酸片段进行靶向结合并切割， DNA片段可以是有编码功能也可以是没有编码功能的。另外，研究表明CRISPR/Cas9体系的脱靶效应要远低于RNA干扰。最为重要的是利用CRISPR/Cas9体系编辑的细胞单克隆表型长时间内较稳定，可以用于动物体内研究，因此本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑方法进行相关研究[16]。实验结果显示,COL1A1基因敲除可在体外抑制细胞的增长与迁移，在体内可减慢肿瘤的生长速度。COL1A1敲除的卵巢癌细胞被阻滞在G2期，促凋亡基因Noxa和调控细胞周期的p16基因表达增多。此外，细胞增殖相关蛋白Ki-67和p-histone H3在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中低表达，而凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中高表达。这些结果表明，在卵巢癌细胞中敲除COL1A1可以影响细胞周期、抑制细胞增殖，通过影响caspase-3蛋白的表达从而影响细胞凋亡。为了寻找分子机制，我们查阅文献发现COL1A1敲除影响多种靶基因表达。osterix能够直接与COL1A1的启动子结合诱导COL1A1基因表达[17]。RT-qPCR验证显示无论在体内还是体外COL1A1敲除的卵巢癌细胞osterix和MMP-13表达减少，agrecanase-1表达上升。

基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类具有锌离子依赖性的内源性蛋白水解酶，可介导肿瘤新生血管的形成，调节肿瘤细胞与基质的黏附，激活具有潜在活性的蛋白来影响肿瘤转移。研究表明，MMP-1和MMP-9与胃癌发展和转移有着密切联系[18]。MMP-13即胶原酶3在各种生理和病理条件下降解ECM，作用于胶原纤维Ⅳ型和Ⅴ型软骨胶元质，层粘蛋白等，与胃癌、非小细胞肺癌等的浸润与转移有关[19-20]。Li等[21]结果显示MMP-13基因启动子区功能多态性与上皮性卵巢癌的发病有关。本研究结果显示在COL1A1敲除的卵巢癌细胞中，MMP-13表达减少，可猜测COL1A1能抑制MMP-13表达从而减少卵巢癌细胞的增殖转移。而aggrecanase-1表达上升,可能与其聚集作用相关，增加细胞外基质合成，抑制卵巢癌细胞转移。

MAPK信号通路参与多种肿瘤细胞增殖，分化，凋亡和迁移等生物学过程[22]。有研究显示p38 或 ERK1/2 MAPK信号通路可以影响COL1A1的转录[15]。本研究显示COL1A1敲除的卵巢癌细胞p-ERK1/2表达量增加，这表明在卵巢癌细胞中ERK1/2 MAPK信号通路也与COL1A1的表达有关。

综上所述，COL1A1可以通过影响不同基因转录及信号通路蛋白表达，从而调控卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和DNA损伤。因此，COL1A1可以作为卵巢癌治疗的分子靶点，来减缓肿瘤发展速度。