TRIM8在高糖高脂诱导的小鼠心肌细胞凋亡中的作用*

唐名扬, 宋志平, 侯娟妮, 冯 健, 冯 娟, 裴海峰△, 杨永健, △

(1 川北医学院， 四川 南充 637000； 2西部战区总医院心内科， 四川 成都 610083)

目前，糖尿病已成为发达国家及发展中国家共同面对的巨大健康难题，根据国际糖尿病联盟的统计，2017年全球糖尿病患者人数已达4.25亿[1]，其中2型糖尿病占所有糖尿病患者的90%，不仅如此，60%的2型糖尿病患者常常伴有血脂异常，主要表现为血中甘油三酯升高、低密度脂蛋白胆固醇正常或升高、高密度脂蛋白胆固醇降低和游离脂肪酸升高，其中以游离脂肪酸升高最为常见[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要心血管并发症之一，2/3的2型糖尿病患者伴有心血管疾病危险因素或经历过心血管事件，而血脂异常，特别是游离脂肪酸的增加被证实是导致这一现象的主要原因[2-3]。但目前DCM的防治效果并不理想，其庞大的患者人群和不断攀升的发病率已成为严重的公共卫生问题。因此，有必要研究高糖尤其是合并高脂状态下心肌易损性的机制与防范措施。

含三基序蛋白8(tripartite motif-containing protein 8，TRIM8)属于TRIM蛋白家族成员，在固有免疫、炎症反应及胰岛素抵抗等多种病理过程中发挥着重要作用，例如它能够介导非酒精性肝硬化[4]和高脂诱导的肥胖[5]等多种疾病的发生发展。除此之外，Chen等[6]报道TRIM8能够通过介导炎症反应和胰岛素抵抗等途径加重心肌肥厚。上述研究表明，TRIM8与心血管疾病在内的多种疾病的发病机制密切相关，但其在DCM中的作用尚无报道。因此，本研究在前期研究基础上，在细胞水平采用高糖高脂(high glucose and high free acid, HGHF)培养基培养小鼠心肌细胞(mouse cardiomyocytes，MCMs)为模型，旨在研究糖尿病合并高脂的心肌细胞中TRIM8的作用及其相关机制，期望进一步揭示糖尿病心肌病的发生及发展机制。

材 料 和 方 法

1 细胞系及主要试剂

小鼠心肌细胞系购自豪地华拓生物科技有限公司，产品批号：HTX2799。DMEM培养基及胰蛋白酶购自HyClone；胎牛血清购Sigma；TRIzol和Lipofectamine 2000购自Invitrogen；反转录及PCR检测试剂盒购自TaKaRa；qPCR 引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司设计；二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)超氧化物阴离子荧光探针购自凯基生物；annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BD；TRIM8-siRNA及scrambled siRNA (Scra-siRNA)购自锐博生物；抗α-actinin抗体购自Abcam；抗TRIM8抗体购自Santa Cruz；抗核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)抗体购自CST；Nrf2抑制剂ML385购自Selleck。

2 实验方法

2.1高糖高脂心肌细胞的培养 MCMs中加入含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM正常糖培养基(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)，后置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。选择生长良好的对数生长期细胞，接种于6孔培养板中，给予高糖(葡萄糖浓度为33 mmol/L)及软脂酸钠(软脂酸钠浓度为300 μmol/L)培养基干预培养,并按分组进行实验。

2.2免疫荧光染色鉴定小鼠心肌细胞 将MCMs制作成细胞爬片，待细胞生长至70%左右用PBS清洗3次；滴加50 μL破膜工作液，室温孵育20 min后PBS清洗3次；3%牛血清白蛋白均匀覆盖爬片，室温封闭30 min后PBS清洗3次；加入I抗(抗α-actinin抗体，1∶100稀释)4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次；加入II抗(1∶500稀释)37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗3次；滴加DAPI复染核，避光孵育5 min，PBS清洗3次后晾干用抗荧光淬灭封片剂封片，置于荧光显微镜下观察。

2.3流式细胞术检测心肌细胞凋亡水平 用0.25%不含EDTA的胰酶消化收集各组细胞后，预冷PBS洗涤2次，binding buffer重悬细胞，加入 annexin V-FITC及PI各2.5 μL混匀细胞，检测前5 min再加入binding buffer，流式细胞术检测细胞凋亡率，FlowJo软件分析数据。

2.4qPCR 检测心肌细胞TRIM8、Nrf2、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)、血红素加氧酶(heme oxyge-nase-1, HO-1)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1 [NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, NQO-1]的mRNA表达水平 采用TRIzol提取细胞的总RNA，再反转录为cDNA，qPCR扩增(引物序列见表1)，GADPH为内参照，采用 2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA表达量。

表1 qPCR引物序列Table1. ThesequencesoftheprimersforqPCR

2.5Western blot检测心肌细胞TRIM8及Nrf2的含量 取40 μg各组蛋白样品，用SDS-PAGE分离，然后转至PVDF膜上，于5%牛血清白蛋白中室温封闭1 h;再用抗TRIM8抗体(1∶500)、抗Nrf2抗体(1∶1 000)和抗GAPDH抗体(1∶5 000)孵育，于4 ℃过夜;洗膜后再用 II 抗孵育(37 ℃，1 h)，再次洗膜后发光并使用ImageJ软件分析结果。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值。

2.6心肌细胞转染 细胞培养以Lipofectamine 2000作为转染试剂按50 nmol/L浓度进行TRIM8-siRNA转染，每组设3个复孔，其中control组给予Lipofectamine 2000处理，TRIM8-siRNA组给予Lipofectamine 2000+TRIM8-siRNA处理，Scra-siRNA组给予Lipofectamine 2000+Scra-siRNA处理。转染24 h后检测细胞TRIM8 mRNA表达，48 h后检测TRIM8蛋白表达以明确敲减效率。转染48 h后给予33 mmol/L葡萄糖及300 μmol/L软脂酸钠继续干预18 h并检测MCMs的凋亡率、Nrf2表达水平及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平。

2.7DHE染色实验 将DHE荧光探针按5 μmol/L浓度用培养基稀释后加入到各组细胞培养皿中，每组重复3孔，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，采用激光共聚焦显微镜检测DHE荧光水平并拍照。

2.8ML385配制 将ML385溶于100%DMSO中制备储备溶液，接着用PBS稀释成5% DMSO溶液再使用。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 高糖高脂增加MCMs的凋亡及ROS水平

用α-actinin免疫荧光鉴定小鼠心肌细胞,见图1。经流式细胞术检测MCMs的凋亡率，DHE染色法及流式细胞术检测MCMs中ROS的含量，结果显示在HGHF环境中，MCMs的凋亡率及ROS水平增加(P<0.05),见图2、3。上述结果表明HGHF能增加MCMs的凋亡，氧化应激反应增强是HGHF致MCMs损伤的原因之一。

Figure 1. The identification of mouse cardiomyocytes. The scale bar=50 μm.
图1 小鼠心肌细胞的鉴定

Figure 2. The effect of HGHF on the apoptosis of the MCMs 18 h after intervention was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group.
图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

Figure 3. The effect of HGHF on the ROS production in the MCMs was detected by DHE staining (×400) and flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group.
图3 流式细胞术检测各组细胞ROS的生成

2 高糖高脂增加MCMs中TRIM8的表达水平

qPCR及Western blot检测MCMs中TRIM8的表达水平，结果显示在单独HG及HF的作用下，MCMs中TRIM8的表达增加，HG合并HF可进一步增加TRIM8的表达，其表达量随着干预时间的延长而增加(P<0.05)，见图4、5。

Figure 4. The expression of TRIM8 in the MCMs exposed to HGHF. A: the mRNA expression of TRIM8 was detected by qPCR; B: the results of Western blot for determining the protein expression of TRIM8. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group;#P<0.05vsHG group;△P<0.05vsHF group.
图4 HGHF对各组细胞TRIM8 mRNA和蛋白表达的影响

Figure 5. The expression of TRIM8 in the MCMs exposed to HGHF for different time. A: the mRNA expression of TRIM8 was detected by qPCR; B: the results of Western blot for determining the protein expression of TRIM8. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vs6 h group;△P<0.05vs12 h group.
图5 HGHF对各组细胞TRIM8 mRNA和蛋白表达的影响

3 敲减TRIM8的表达减轻MCMs的凋亡并降低ROS水平

采用siRNA敲减MCMs中TRIM8的表达，通过qPCR及Western blot检测对TRIM8的沉默效率，结果表明TRIM8 siRNA成功抑制了TRIM8在MCMs中的表达水平(P<0.05)，见图6。经流式细胞术检测细胞凋亡率，DHE染色法及流式细胞术检测MCMs中ROS的含量，结果表明TRIM8 siRNA/HGHF组MCMs的凋亡率及ROS水平明显降低(P<0.05)，见图7。

Figure 6. The effects ofTRIM8expression knock-down on the expression of TRIM8 at mRNA and protein levels in the MCMs with or without HGHF exposure. A: the mRNA expression of TRIM8 in the MCMs after siRNA transfection for determining the knock-down efficiency; B and C: the effects ofTRIM8expression knock-down on the expression of TRIM8 at mRNA and protein levels in the MCMs exposed to HGHF. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsScra-siRNA group;△P<0.05vsScra-siRNA/PBS group;▲P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
图6 敲减TRIM8在MCMs中的效率验证和对HGHF作用的影响

Figure 7. Knock-down ofTRIM8expression attenuated the apoptosis and ROS production in the MCMs exposed to HGHF. A: the results of flow cytometry for analyzing the apoptosis of the MCMs exposed to HGHF 18 h after intervention; B: the results of DHE staining (×400) and flow cytometry for analyzing the ROS production in MCMs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsScra-siRNA/PBS group;#P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
图7 敲减TRIM8表达减轻MCMs凋亡并降低ROS水平

4 高糖高脂减少MCMs中Nrf2的表达水平

Western blot检测MCMs中Nrf2的蛋白表达水平，qPCR检测Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达水平，结果表明在HGHF作用下，MCMs中的Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达降低(P<0.05)，见图8、9。

Figure 8. The effect of HGHF on the expression of Nrf2 in the MCMs. A: the mRNA expression detected by qPCR; B: the protein expression determined by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs NG group.图8 qPCR和Western blot检测HGHF 对MCMs Nrf2蛋白表达的影响

Figure 9. The effect of HGHF on the mRNA expression of the down-stream molecules of Nrf2 signalling pathway was detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group.
图9 qPCR检测MCMs内Nrf2信号通路下游分子mRNA的表达

5 敲减TRIM8的表达增加MCMs中Nrf2的表达水平

敲减TRIM8的表达水平后，qPCR及Western blot检测MCMs中Nrf2的表达水平，结果显示TRIM8-siRNA/HGHF组的Nrf2表达水平升高(P<0.05)，Nrf2下游基因GCLC、HO-1和NQO-1表达亦增加(P<0.05)，表明TRIM8可影响Nrf2抗氧化通路及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达，见图10、11。

Figure 10. The efects ofTRIM8expression knock-down on the expression of Nrf2 at mRNA and protein levels in the MCMs with or without HGHF exposure. A: the mRNA expression was detected by qPCR; B: the protein expression determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsScra-siRNA/PBS groups;#P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
图10 敲减TRIM8对Nrf2在MCMs中表达和对HGHF作用的影响

Figure 11. The effects ofTRIM8expression knock-down on the mRNA expression of the down-stream molecules of Nrf2 signalling pathway in the MCMs with or without HGHF exposure were detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsScra-siRNA/PBS group;#P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
图11 敲减TRIM8表达对MCMs在HGHF条件下Nrf2信号通路下游分子mRNA表达的影响

6 Nrf2抑制剂ML385部分逆转敲减TRIM8减轻MCMs损伤的作用

在敲减TRIM8表达的同时予以Nrf2特异性抑制剂ML385干预MCMs，qPCR结果显示，在HGHF作用下，同样转染TRIM8-siRNA的细胞，用Nrf2特异性抑制剂ML385(4 μmol/L)干预18 h后，MCMs中的抗氧化分子Nrf2、GCLC、HO-1及NQO-1的表达减少(P<0.05)，见图12。流式细胞术及DHE检测结果显示，MCMs中的ROS及细胞凋亡水平增加(P<0.05)，见图13。这些结果表明 TRIM8通过抑制Nrf2的表达激活氧化应激反应，促进高糖高脂诱导的MCMs凋亡。

Figure 12. The effects of Nrf2 specific inhibitor ML385 andTRIM8expression knock-down on the mRNA expression of the down-stream molecules of Nrf2 signalling pathway in the MCMs with HGHF exposure detected by qPCR. Ts： TRIM8-siRNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHGHF/DMSO group;#P<0.05vsHGHF+Ts/DMSO group.
图12 Nrf2特异性抑制剂ML385和敲减TRIM8表达对MCMs在HGHF条件下Nrf2信号通路下游分子mRNA表达的影响

Figure 13. The effects of Nrf2 specific inhibitor ML385 andTRIM8expression knock-down on the ROS production and apoptosis of MCMs with HGHF exposure. A: DHE staining (×400) and flow cytometry for evaluating the ROS production; B: flow cytometry was used for analyzing the cell apoptosis. Mean±SD.n=6. Ts： TRIM8-siRNA.*P<0.05vsHGHF/DMSO group;#P<0.05vsHGHF+Ts/DMSO group.
图13 Nrf2特异性抑制剂ML385和敲减TRIM8表达对MCMs在HGHF条件下ROS生成和细胞凋亡的影响

讨 论

DCM是一种独立于高血压和冠心病的特异性心肌病，与糖尿病患者心力衰竭的高发生率和死亡率密切相关，且严重影响患者的生活质量。现有研究表明，DCM可能与糖脂代谢异常[7]、炎症反应[8]和氧化应激[9]等多种因素相关，有学者认为氧化应激可能在DCM发生发展中起到关键性作用[10]，在糖尿病合并高脂血症患者中，高糖、高游离脂肪酸将导致心肌细胞内线粒体过氧化产物的堆积，从而导致细胞内ROS的增加，ROS的异常增加可以通过诱导心肌细胞凋亡，最终出现DCM的心脏功能及结构异常。在本研究中，我们采用HGHF培养MCMs来模拟糖尿病合并高脂环境，并检测心肌细胞凋亡率及ROS水平，结果显示在高糖合并高脂环境中，心肌细胞凋亡率及ROS水平增加，这与文献报道一致[11-12]。

近年来，有研究发现，TRIM8能够与多种底物相互作用，调节先天免疫、病毒反应和炎症等病理过程[13-15]。Yan等[4]发现，TRIM8能够通过激活脂代谢、胰岛素抵抗和炎症反应等途径介导肝硬化的发生发展；而在心血管方面，Chen等[6]发现，TRIM8能够通过激活心肌细胞的代谢异常、胰岛素抵抗及炎症等途径加重心肌肥厚及心肌纤维化，以上研究证明TRIM8可能在DCM的发病过程中起作用，但目前暂无相关报道。在本研究中，用HG和HF分别干预MCMs后，TRIM8的表达明显升高，而在HG合并HF的作用下，TRIM8的表达水平进一步升高，其表达量随着干预时间的延长而增加，为了进一步探索TRIM8在DCM中的作用，我们给予心肌细胞特异性siRNA 来降低MCMs的TRIM8水平，结果显示，降低TRIM8的表达能够减轻MCMs的凋亡及 ROS 的生成。

既往有文献报道，Nrf2所介导的抗氧化应激反应通路是细胞内最主要的抵御氧化应激产生的细胞毒性作用的途径，当激活Nrf2后, 将启动其下游GCLC、HO-1和NQO-1基因的转录及高效表达, 从而减轻ROS的产生，保护机体免受氧化应激的损伤[16-19]。在本研究中，我们观察到HGHF干预后，MCMs中抗氧化分子Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达降低。既往研究发现，在病理情况下，TRIM8能够通过Nrf2相关信号通路调节组织内氧化应激水平[20]，所以我们推测TRIM8介导高糖高脂诱导心肌细胞凋亡的作用可能是通过调节Nrf2抗氧化通路产生的。本实验发现降低TRIM8的表达能够增加MCMs中Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达，为了进一步明确此机制，我们给予Nrf2特异性抑制剂ML385抑制Nrf2的表达，结果显示ML385可降低细胞内Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达，升高ROS的含量，逆转了敲减TRIM8表达减轻HGHF诱导MCMs凋亡的作用。上述结果表明TRIM8能够通过抑制Nrf2通路的表达激活氧化应激反应增加高糖高脂诱导的心肌细胞凋亡。有文献报道，TRIM8是TNF-α和IL-1β介导的NF-κB活性的关键调控分子[4, 6, 20]，在DCM中，体内高血糖与蛋白质产生非酶糖化反应生成糖基化终产物，糖基化终产物修饰的蛋白质和脂质与心肌细胞表面的受体结合，使NF-κB表达增加，从而激活炎症途径，导致抗氧化分子减少以及大量的ROS产生，进而诱导细胞凋亡[21-22]。综合之前的报道，我们推测在高糖高脂环境中，TRIM8可能通过激活NF-κB炎症通路导致Nrf2抗氧化分子减少，从而使心肌细胞氧化应激水平增加，最终引起心肌细胞凋亡，故仍需在下一步实验中明确TRIM8影响细胞内Nrf2通路及其氧化应激的具体机制。

综上所述，TRIM8通过抑制Nrf2通路的表达激活氧化应激反应增加高糖高脂诱导的心肌细胞凋亡。这为糖尿病患者心血管方面的防护提供了新的理论基础，有利于开发新的干预靶点和治疗措施。