高效液相色谱法测定自制红曲米中麦角固醇的含量

李雨恒，孙晓东，刘润璞，杨灵丝

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116600)

红曲又称“丹曲”、“赤曲”，在我国已有一千多年的食用历史，被广泛应用于酿酒、发酵、调味剂、着色剂和药物等方面[1-3]。1979年日本远藤氏从红曲中发现了可以抑制胆固醇合成的Monacolin K[4]，红曲及其发酵产物渐渐走入人们的视线。此后研究发现红曲具有抗菌抑菌、降血压、防癌和防止佝偻病等多种功效[5，6]，更加被人们所关注。麦角固醇又名麦角甾醇，最早发现于小麦的寄生菌——麦角菌中，其含量与真菌生物量存在正相关，在红曲米的固态发酵产物中可通过麦角固醇的含量来衡量发酵菌株的生物量[7，8]。麦角固醇经紫外线照射可转变为维生素D，促使老人与孕妇对钙和磷的吸收，同时它用于可的松、激素黄体酮的生产，是重要的医药化工原料[9，10]。红曲米固态发酵产生麦角固醇的适宜温度为26～30 ℃，此时可得到较高的产量，而温度的升高不利于真菌产麦角固醇[11]，因此本研究3种菌发酵自制红曲米的温度为28 ℃。本研究为筛选麦角固醇生产菌，提高红曲米的药用价值奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验中的3株菌均为紫红曲霉(Monascuspurpureus)，其中SD3分离自山东柿饼，Fen和A13分离自丹东家庭自制豆酱。3株菌均于实验室4 ℃保存。

1.2 试剂

提取用无水乙醇、乙醚、氢氧化钠：均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；麦角固醇标准品(纯度≥98%)：上海源叶生物技术有限公司；液相用乙醇、甲醇：色谱纯，德国默克公司；泰国香米：购于超市；水：超纯水。

1.3 仪器设备

Agilent 1260 型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；XFH-75C电热式压力蒸汽灭菌锅 深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司；HZQ-Q全温振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；CP225D 型电子天平 德国 Sartorius公司；Milli-Q Advantage A10超纯水仪 美国Millipore公司；101-3AB电热恒温鼓风干燥箱 上海坤天实验室仪器有限公司；HH-3D恒温水浴锅 上海仪纯实业有限公司；SW-CJ-2D双人净化工作台 上海沪净净化设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

将3株菌接种于PDA平板上，于30 ℃培养7 d。

1.4.2 液体发酵培养

制作种子培养基：葡萄糖60 g，蛋白胨25 g， NaNO32 g， MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO4·3H2O 1 g，pH为5.5，121 ℃灭菌20 min。

将3株菌接入种子培养基中，28 ℃,180 r/min培养7 d。

1.4.3 红曲米的制备

将从超市购入的泰国香米浸泡过夜，沥干水分，放入500 mL罐头瓶中，每瓶100 g， 121 ℃灭菌60 min。超净台中加入20 mL液体发酵后的菌液，每种菌3个重复， 28 ℃黑暗培养15 d。

1.4.4 红曲米的烘干

将自制红曲米均匀平铺于滤纸上，置于60 ℃烘干箱中4 h。将烘干后的红曲米收集，碾碎保存。

1.4.5 麦角固醇样品的制备

称取50 g NaOH于80 mL超纯水中，用无水乙醇定容到200 mL，配制成碱乙醇溶液。精确称取0.5 g烘干后的红曲米于比色管中，取16 mL碱乙醇加入到比色管中，放入85 ℃的恒温水浴锅中，皂化1.5 h后向其中补加乙醇至20 mL，继续皂化1 h，取出，冷却至室温。加入10 mL乙醚并震荡30 s，静置40 min，用超纯水水洗至中性，放入40 ℃的水浴锅中将乙醚全部蒸干。向比色管中加入甲醇，使麦角固醇完全溶解，经0.45 μm的膜微滤，得到标准样品溶液。

1.4.6 高效液相法检测麦角固醇

1.4.6.1 麦角固醇标准溶液的制备

精确称取100 mg(精确到0.0001 g)标准品用乙醇溶解，并定容至100 mL，制成1 mg/mL的标准储备液，用储备液配制10，100，500，1000 μg/mL的标准液，置于4 ℃保存。

1.4.6.2 色谱条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260；色谱柱ZORBAXEclipse SB-C18(5，250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：甲醇；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测器：紫外可见光检测器；检测波长：284.0 nm；进样量：20.000 μL。

1.4.6.3 麦角固醇含量的计算

式中：C为红曲米中麦角固醇的含量，mg/g；C1为由标准曲线求得的样品浓度，μg/mL；V为皂化提取时加入甲醇的体积，mL；m为提取红曲样品的质量，g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

取上述配制的四种标准溶液进行高效液相检测，以峰面积为纵坐标，麦角固醇浓度为横坐标，绘制标准曲线(见图1)，进行线性回归，回归方程为y=0.1709x+0.3194，R2=0.9996。

图1 麦角固醇的标准曲线Fig.1 Standard curve of ergosterol

由图1可知，麦角固醇在10～1000 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 样品中麦角固醇的含量

通过计算得出Fen、SD3和A13固态发酵产物中麦角固醇的含量，结果见表1。

表1 样品中麦角固醇的含量Table 1 The content of ergosterol in the samples

由表1可知，A13和Fen固体发酵的状态相近，两株菌均来自于丹东家庭自制豆酱，发酵中产麦角固醇的含量高于来自山东柿饼的SD3。

3 讨论

许莉等对山西康欣药业有限公司的银蜜片中的麦角固醇进行测定，含量在0.015 mg/g左右浮动[12]；来李娟等对山西云鹏制药有限公司的猴头菌片中的麦角固醇含量进行测定，含量在0.26 mg/g左右浮动[13]。这些药品中均含有麦角固醇，其作用为降胆固醇、预防心脑血管疾病等，并广泛存在于真菌子实体和发酵的菌丝中。检测麦角固醇含量的方法主要有紫外分光光度法和高效液相色谱法。酵母在发酵过程中产生的代谢产物简单，故采用简单易行的紫外分光光度法；而红曲霉代谢产物丰富而干扰实验结果，现基本采用高效液相色谱法来进行含量的测定[14，15]。红曲霉中许多菌株均能不同程度地产生麦角固醇[16]，本研究前期所获得的3种红曲霉麦角固醇的产量差异较大，其中Fen和A13均分离于丹东家庭自制豆酱，相同的分离基质发酵产生的麦角固醇Fen却远远高于A13，而分离自柿饼中的SD3产生极其微量的麦角固醇，说明菌株间发酵产麦角固醇的能力存在着明显的差异。麦角固醇作为新兴的、重要的药用物质，已逐渐被人们所关注。朱效刚等利用红曲菌SJS-20发酵，并对其产麦角固醇的条件进行了优化，得到麦角固醇的最高产量为8.1 mg/g[17]。研究获得的紫红曲霉Fen可以通过优化发酵条件和发酵基质来提高麦角固醇的产量。

4 结论

麦角固醇为安全无害的医药原料，具有降血压、降血脂、预防骨质疏松等重要的作用。本研究利用筛选到的紫红曲霉Fen发酵制成红曲米，通过高效液相色谱检测，得到了含量相对较高的麦角固醇，研究为提高麦角固醇的产量，提高红曲米的品质和药用价值奠定了坚实的基础。