Folin-Ciocalteu比色法测定昭通青花椒总酚含量

熊汝琴，李平，王锐

(昭通学院 化学化工学院，云南 昭通 657000)

青花椒(Zanthoxylumschinifolium)为芸香科(Rutaceae)花椒属(ZanthoxylumL.)植物青椒的干燥果皮，又名香椒子、崖椒、野椒、青椒、狗椒。因其麻味纯正、气味清香、颜色清爽而在各地菜肴尤其是川菜中广泛使用，深受消费者喜爱。青花椒不仅是常用调味品，也是《中华人民共和国药典》收载的常用中药材，具有温中止痛、杀虫止痒的功能，可用于治疗脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛、湿疹瘙痒等症状[1-3]。青花椒喜光、耐寒、耐旱，对生长环境的适应能力较强，在我国栽培历史悠久，分布范围广泛，四川金阳、重庆江津、贵州、云南等地已经把青花椒作为主要的经济作物之一。云南省昭通地区因其独特的海拔及光热条件，非常适合青花椒种植，目前种植面积已超过100万亩，产量约占全省的60.0%～70.0%。近年来，昭通市高度重视青花椒产业发展，青花椒在种植规模、管理水平、产品品质上具有较大提高。

目前，大多数对花椒化学成分的研究报道主要集中于陕西、甘肃、四川、重庆等全国闻名的花椒种植基地所产花椒，主要以研究挥发油、酰胺类化合物、生物碱、黄酮等为主[4-11]。近年来，花椒中的酚性成分因具有独特的药理活性而受到关注。研究表明花椒多酚粗提物具有较强的抗氧化能力和清除自由基能力[12，13]，在动物实验中显示出抗抑郁作用，改善D-半乳糖衰老模型小鼠的学习记忆能力，改善老年痴呆症状的作用[14-16]。但是，由于产地的气候、雨量、日照和土质等诸多自然因素的不同，不同产地花椒的化学组成及含量有很大差异。而昭通青花椒的种植面积虽不断扩大，但对其化学成分的系统研究却鲜有报道，缺乏理论数据的支撑，加上临近四川、重庆等花椒种植基地，使昭通青花椒的市场竞争力较弱，品牌效应不高。因此，本文采用Folin-Ciocalteu比色法测定昭通几个县区所产青花椒总酚成分含量，期望增加昭通青花椒的附加值，为青花椒的质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青花椒样品分别采于昭通市大关县、盐津县、鲁甸县、永善县、彝良县、巧家县和镇雄县。

Folin-Ciocalteu试剂：AR，国药集团化学试剂有限公司；无水Na2CO3：AR，天津市福晨化学试剂厂；没食子酸标准品：中国药品生物制品检定所，供定量测定用；无水乙醇：AR，成都市联合化工试剂研究所；二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

HH-S24型数显恒温水浴锅 江苏仪器厂；SK3200HP型超声提取器 上海科导超声仪器有限公司；YB-150型高速多功能粉碎机 永康市速锋工贸有限公司；3111000831型移液器 德国 Eppendorf公司；UV756紫外可见分光光度计 上海奥普勒仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

将昭通各县区青花椒粉碎，过30目筛，分别称取2.0000 g花椒粉，加60%乙醇50 mL，25 ℃超声提取[17]，常温过滤制得花椒样液。

1.3.2 标准曲线的绘制

准确称取0.1000 g没食子酸标准品，蒸馏水溶解定容至100 mL，准确移取1.0 mg/mL没食子酸标准溶液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL于100 mL容量瓶中，加入60 mL蒸馏水，再加入Folin-Ciocalteu试剂1.00 mL并摇匀，静置2～3 min，加入10%的Na2CO3溶液5.00 mL后用蒸馏水定容，在25 ℃恒温水浴锅中放置反应120 min，在765 nm处分别测定吸光度，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 青花椒中总酚含量的测定

精确吸取0.10 mL花椒样液，加60 mL蒸馏水，再加入1.00 mL福林酚试剂，摇匀，放置2～3 min后，加入5.00 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至100 mL，置于25 ℃恒温水浴锅中显色120 min，于765 nm处测吸光度，按标准曲线计算浓度，代入公式求总酚含量。

式中：ω为总酚含量(mg/g)；C为没食子酸质量浓度(μg/mL)；V为提取液体积(mL)；N为稀释倍数；M为取样量(g)。

2 结果与分析

2.1 超声提取时间的选择

准确称取2.0000 g大关产青花椒粉末，加入60%50 mL乙醇溶液，于25 ℃分别超声提取10～80 min(10 min/次)，常温下分别过滤制得花椒样液，精确吸取0.10 mL样品液于100 mL容量瓶中，依次加入60 mL蒸馏水，1.00 mL福林酚试剂，摇匀，放置2～3 min，加入5.00 mL 10% Na2CO3溶液后用蒸馏水定容，在25 ℃水浴锅中显色120 min后于765 nm处测定吸光度，结果见表1和图1。

图1 提取时间与吸光度的关系Fig.1 The relationship between extraction time and absorbance

由图1可知，提取时间达60 min后吸光度随时间增加不明显，因此选择60 min作为超声提取时间。

2.2 显色反应条件的确定

2.2.1 Na2CO3溶液用量的确定

准确称取2.0000 g大关产青花椒粉末，加入60%的乙醇50 mL，于25 ℃超声提取60 min，常温下过滤制得花椒样液。准确移取0.10 mL花椒样液于100 mL容量瓶中加入蒸馏水60 mL，再加入福林酚试剂1.00 mL并摇匀，静置2～3 min，分别加入不同体积的10% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容，在25 ℃恒温水浴锅中显色120 min，于765 nm处测吸光度，结果见表2和图2。

表2 Na2CO3溶液用量的确定实验Table 2 Experiment for determining the dosage of Na2CO3 solution

图2 Na2CO3溶液用量与吸光度的关系Fig.2 The relationship between the dosage of Na2CO3 solution and absorbance

由图2可知，当10% Na2CO3溶液的体积为5.00 mL时效果最佳，因此确定10% Na2CO3溶液用量为5.00 mL。

2.2.2 显色时间的确定

准确移取0.10 mL大关产青花椒样液，于100 mL容量瓶中，加入60 mL蒸馏水，再加入1.00 mL福林酚试剂并摇匀，静置2～3 min，加入10%的Na2CO3溶液5.00 mL后用蒸馏水定容，在25 ℃恒温水浴锅中放置反应20 min后开始，每隔20 min在765 nm处分别测定吸光度，结果见表3和图3。

表3 显色时间的确定实验Table 3 Experiment for determining chromogenic time

图3 显色时间与吸光度的关系Fig.3 The relationship between chromogenic time and absorbance

由图3可知，显色反应在120 min后趋于稳定,因此选择显色反应时间为120 min。

2.3 标准曲线的绘制

准确移取1.0 mg/mL没食子酸标准溶液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL于100 mL容量瓶中，加入60 mL蒸馏水，再加入Folin-Ciocalteu试剂1.00 mL并摇匀，静置2～3 min，加入10%的Na2CO35.00 mL后用蒸馏水定容，在25 ℃恒温水浴锅中放置反应120 min，在765 nm处测定吸光度，结果见表4和图4。

表4 标准曲线绘制实验Table 4 Experiment for drawing standard curve

图4 标准曲线Fig.4 The standard curve

由图4可知，没食子酸浓度在0～5 μg/mL内与吸光度线性关系良好，线性回归方程y=0.0873x+0.0095，r=0.9991。

2.4 加标回收率实验

准确吸取大关青花椒样液0.10 mL，分别加入0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mL的1.0 mg/mL没食子酸标准溶液，按2.3实验方法测吸光度并计算回收率，结果见表5。平均回收率为100.1%，表明采用Folin-Ciocalteu比色法测定昭通青花椒总酚含量具有良好的精密度、准确性和稳定性，测定结果准确可靠。

表5 加标回收率实验Table 5 Recovery rate experiment

2.5 昭通青花椒总酚含量测定

分别取昭通市大关、盐津、鲁甸、永善、彝良、巧家、镇雄几个县区所产青花椒样品，按前述2.1制取样品液，按2.2确定实验条件进行显色反应后测定吸光度值，并根据标准曲线计算总酚含量，平行测定5份，计算结果见表6。

表6 昭通青花椒总酚含量测定Table 6 Determination of total phenols in Zhaotong Zanthoxylum schinifolium

镇雄县青花椒总酚平均含量为52.57 mg/g，RSD为0.43%；彝良县青花椒总酚平均含量为53.54 mg/g，RSD为0.90%；永善县青花椒总酚平均含量为53.96 mg/g，RSD为0.17%；巧家县青花椒总酚平均含量为54.25 mg/g，RSD为0.80%；鲁甸县青花椒总酚平均含量为57.12 mg/g，RSD为0.61%；盐津县青花椒总酚平均含量为58.77 mg/g，RSD为0.54%；大关县青花椒总酚平均含量为62.07 mg/g，RSD为0.92%；重复性较好。

3 结论

花椒中的酚性成分具有多种重要生理作用，本文以60%乙醇溶液在25 ℃超声1 h提取昭通青花椒酚性成分。采用Folin-Ciocalteu比色法，确定10% Na2CO3溶液用量为5.00 mL，Folin-Ciocalteu试剂用量为1.00 mL，显色时间为120 min，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，y=0.0873x+0.0095，r=0.9991，浓度在0～5 μg/mL内与吸光度线性关系良好。按以上实验条件测得昭通七县区青花椒总酚含量范围为52.57～62.07 mg/g，平均总酚含量为56.04 mg/g，回收率为100.1%，相对标准偏差(RSD)为0.39%。结果表明该方法操作简便，重复性好，检测结果准确可靠，可为昭通青花椒的品质研究提供实验参考。