肠道微生态调节对移植物抗宿主病防治的研究进展

张晋瑄，易 海，林 宁

移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease, GVHD)是一种特异的免疫现象，是移植物组织中的免疫活性细胞与免疫受抑制的、组织不相容性抗原受者的组织之间的反应。移植物抗宿主病、感染、复发是异基因造血干细胞移植(Allogenic hematopoietic stem cell transplantation, Allo-HSCT)的主要死亡原因，其中移植物抗宿主病较常见。2016年西奈山急性GVHD研究联盟(Mount Sinai Acute GVHD International Consortium)指南[1]将GVHD严重程度根据皮肤、肝脏和消化道症状分为五级。肠道的排异主要表现为大量腹泻、血便和肠梗阻症状。

肠道作为机体最大的免疫器官在多种疾病发生发展中发挥重要作用，肠道正常定植的微生物在其中扮演重要角色。在异基因造血干细胞移植中，因肠道对自身免疫因素干扰较强，临床上通常在移植前先行使用药物对肠道菌群进行“清扫”，以减少肠道来源的排异反应。Jenq RR[2]的研究表明，HSCT后微生物多样性的丧失会导致更高的死亡率，大剂量使用抗生素对肠道微生物系统产生了不良作用。在Ernst Holler[3]的研究中，良好的肠道微生物系统对患者的生存率和结局都是有益的，在同样使用抗生素的前提下，正常的肠道微生物群可以重构患者肠内免疫屏障，不但让患者得以在症状上缓解，而且从长远的角度来看增加患者的生存质量，提高患者的生存率，对患者的积极作用远大于消极作用。由此可见，肠道的微生态在异基因造血干细胞移植中扮演重要角色，但是其在GVHD中的作用和使用方法未见系统报道。

1 益生元在GVHD中的作用

1.1 益生元的概念与种类 益生元(prebiosis)是指需要经由肠道微生物代谢后转化为可被肠上皮细胞(intestinal epithelial cell, IEC)利用的营养物，从而改善整体健康的难消化碳水化合物[4]。在2004年益生元的定义更新为“一种选择性发酵成分，可以特定改变胃肠道微生物群落的组成和/或活性，从而赋予宿主健康益处”[5]。2007年，粮农组织与世界卫生组织描述益生元为“一种可以赋予宿主健康的，与调控微生物有关的无活力的食物成分”[6]。益生元在肠道内通常由不同长度的糖链组合成难以消化的寡糖和多糖(体外研究显示最令人满意的一般为低聚糖)，在肠道微生物作用下分解为短链脂肪酸提供能量并改善肠道免疫力。已知的通常益生元仅限于多糖菊粉及其衍生物与低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、异麦芽低聚糖(IMO)等[7-8]。

1.2 益生元对GVHD结局的影响 Satoshi Iyama等人[9]进行了谷氨酰胺、纤维素和果寡糖(GFO)对于异体移植患者的回顾性队列研究，主要探讨了其有效性和安全性。其中22名受试者接受了谷氨酰胺、纤维素和果寡糖，自起始治疗前7天开始，每日三次口服益生元粉(每包GFO含3g谷氨酰胺、5g膳食纤维、1.5g低聚糖及1.2mg钠)，至治疗后28天截止，若出现严重排异者则停止给药。相较回顾同期未接受治疗患者22名而言，在性别、年龄、ECOG体力评分状态、基础诊断、疾病状态、调理方案、GVHD预防、与移植物来源无显著差异的情况下，干预组补充使用GFO与中度腹泻(2级，P=0.0001)，严重腹泻(3-4级，P=0.001)和严重粘膜炎(3-4级，P=0.033)明显的患病天数减少显著相关，接受补充剂的患者与未接受补充剂的患者的生存率存在显著差异(分别为100%和77%，P=0.0091)。该研究的局限在于是回顾性分析，且样本量较小。

2 益生菌在GVHD中的作用

2.1 益生菌的概念与种类 2002年联合国粮食农业组织与世界卫生组织将益生菌定义为“经过严格挑选的微生物‘活菌株’，足量使用时，可以对宿主健康提供益处”[10]，此定义在2013年由国际益生菌和益生元科学协会再次确认[11]。人类常用的益生菌一般包含以下种类：乳杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、链球菌、肠球菌，此外还包含一些属于芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌菌株和属于酵母菌属的酵母菌株[12]。益生菌主要可以对生物体内的微生物群发育产生影响，维持与病原体之间的平衡和生物体的正常功能。此外，其在功能性食品的生产、食品的保存、抗生素使用后天然微生物群的恢复、抵抗污染食物与环境中病原微生物群的等活动中也有不可或缺的作用。益生菌主要通过菌株共聚集能力，形成保护屏障，防止病原菌定植。益生菌附着在宿主肠道上皮细胞激活了导致免疫调节相关的信号传导通路，对免疫调节产生一定影响，并产生小分子量物质(如过氧化氢物与短链脂肪酸)抑制病原体复制作用[13-14]。

2.2 益生菌对GVHD的作用 益生菌(probiosis)因在肠道免疫调节方面十分重要，因此也被临床上广泛使用。EJ Ladas等人[15]在2010年1月至2014年6月间随机选取30名接受移植的儿童，通过口服或管饲方式给予特殊益生菌(植物乳杆菌，LBP(1*10^8菌落形成单位/kg/天)。结果显示，于观察期内(100天)接受益生菌移植后的死亡受试者中无一人存在GVHD的诊断，但在100天后有9名患者被诊断为GVHD(其中5名患者被诊断为2 级，4名患者被诊断为3级)。与此同时有7名患者(23%)出现急性胃肠道GVHD症状,其中3名患者诊断为1级胃肠道急性移植物抗宿主病(gastrointestinal acute graft-versus-host disease，GI aGVHD)，有4名患者诊断为3级GI aGVHD，没有患者到达4级GI aGVHD的诊断。在文章的最后作者指出,尽管在试验中给予植物乳杆菌并未形成单独的致病菌落，但是通过口服方式给药仍不是推荐途径。Elan Gorshein等人[16]将31名异基因干细胞移植术后患者分成2组，其中20名患者给予口服胶囊形式补充活鼠李乳杆菌特定益生菌GG(由Culturelle提供的100亿活鼠李糖乳杆菌GG的胶囊)，另11人给予常规治疗，分别于第3个月、第6个月及第12个月末记录患者症状与结局。研究发现益生菌GG提高了肠道微生态的多样性和丰富度，但和对照组相比没有显著差异，相对于GVHD的症状改善也并未体现出明显优势。在动物实验也存在相似的结论。AnaC T Mercadante等[17]人对8-14周龄的小鼠通过口服喂养益生菌联合B细胞诱导，观察动物体重减轻、皮毛质地、活动、姿势、粪便稠度及存活率指标，实验组GVHD发生率较对照组(未干预)降低，并在移植后21天进行组织器官病理学评分，发现实验组脾脏肝脏消化道等器官受损程度较低。

3 合生元在GVHD中的作用

合生元(synbiosis)一般是将益生元与益生菌进行混合，使其在功能和作用上达到相互协同的作用，继而进一步改善肠道微生态或调节免疫功能。合生元还能刺激特定肠道天然细菌菌株(乳酸杆菌、双歧杆菌等)的增殖[18]。合生元在体内通过益生元刺激益生菌调节肠道内的代谢活动，维持正常微生物结构，发展有益的微生物群，抑制胃肠道中存在的潜在病原体[19]。在合生元中，低聚糖与双歧杆菌属或乳杆菌属细菌最为常见，常被用于有胃肠道反应的患者中。目前对于合生元在GVHD中使用的人群研究未见报道，同样在动物实验中亦未见报道。但根据Fozia Noor等人[20]在2018年的文章中所述，当前两项研究(抗性淀粉与益生菌对GVHD的抵抗作用)正在进行，故尚未有结果发表。

4 粪菌移植对GVHD的作用

4.1 粪菌移植的概念与功能 粪菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)是指其将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。粪菌移植属于微生态系统治疗的手段之一，而这种手段在2013年就得以应用于C difficile感染的2名患者的治疗中[21]。FMT可以通过免疫介导的途径调节肠粘膜屏障功能的修复，通过天然微生物群连续信号转导维持优势结构和功能，增强自身免疫抵抗病原体[22]。肠粘膜的上皮细胞群(如肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠道干细胞等)会受到预处理方案(激素使用等)和急性GVHD的联合作用或二者对其的单独影响[23]。此外，FMT可调节性T细胞与先天性淋巴细胞(ILCs)产生的Th17类细胞因子，增加白介素22(IL-22)在肠道内的含量。ILCs是受损组织恢复与再生的重要组成部分，但是其作用可能受到持续性损伤的限制[24]。GVHD引起的ILCs损伤可能导致信号丢失，但是白介素22可以限制GVHD所引起的肠道病变的严重程度而发挥保护作用[25]。FMT可以为GVHD提供必要的强直信号促进上皮再生、黏蛋白与抗微生物肽的产生，其对免疫和上皮细胞的有益作用可以减轻GVHD的严重程度[26-27]。

4.2 粪菌移植对GVHD的作用 Webb B J[28]等人在2016年主要针对艰难梭菌感染问题做了相关性研究，由于艰难梭菌感染与GVHD的关联程度较高，故将其作为GVHD的相关性指标之一。其团队在2015年2月至2016年2月对7名异基因干细胞移植术后患者分别进行8次粪菌移植，其中5名患者通过鼻-空肠管给药，一名患者接受结肠镜给药，1名患者同时接受两种方式。5名患者接受预防性使用免疫抑制剂，2名患者已出现肠道GVHD反应。在试验过程中，没有发现重大不良事件，全因死亡率为0%，只有一名患者粪菌移植术后10天出现腹痛且自行缓解，临床怀疑为小肠细菌过度生长。就给药方式而言，通过鼻-空肠管途径给药具有良好的耐受性，降低了由于鼻胃管滴注的可能引起的误吸风险并提高了患者的满意度。该方法比结肠镜给药便宜，并且不会使患者暴露于清醒镇静或肠内吹气的风险中。Kazuhiko Kakihana[29]同年发表的研究显示，对4名急性髓系白血病GVHD患者(3名患者被诊断为迟发型急性GVHD)通过鼻-十二指肠管给药途径分别于异基因干细胞移植给予甲泼尼龙后(第一阶段)和收集粪便后(第二阶段，中位数6小时)两次给予FMT，对不同患者根据移植类型、症状程度等予以1mg/kg或2mg/kg剂量，移植后对粪便进行检测，并对症状进行综合评价。结果表明FMT的治疗有效(其中3名患者完全缓解，1名部分缓解)，且在激素抵抗病例中数天内观察到胃肠道症状的改善。此外，在3名患者中，激素剂量比FMT之前减少一半以上(平均减少69%)，表明FMT可能通过改变肠道微生态将全身同种异体免疫反应转变为抗炎状态，并可能对其他急性GVHD有效。Zachariah DeFilipp等人[30]对13名患者进行FMT，其中2名患者发生3-4级的胃肠道GVHD，1名患者在粪菌移植20天后不但有严重胃肠道GVHD并伴随有细菌感染和多脏器功能衰竭。在随访过程中共6名患者被诊断为中重度慢性GVHD。Xiaofei Qi等[31]人对8名患有激素抵抗胃肠道GVHD患者进行FMT的初步研究中，2名患者由于出现并发症放弃治疗很快死亡，1名患者死于脑出血，1名患者在粪菌移植后第9天因经济问题放弃治疗死亡。总体观察来说，患者在通过粪菌移植后腹痛腹泻症状很快缓解，粪便量和次数减少，甚至在第一次FMT后的2周随访中，2名患者的腹泻和所有其他5名患者的腹痛症状消失。该研究另外回顾了8名常规治疗患者资料作为对照，在90天随访时间中，尽管FMT组患者症状有所改善，但两组之间死亡率并没有显著差异。综上所述，粪菌移植可作为GVHD的治疗选择，但是其有效性仍需进一步探究。

5 展 望

随着生物技术的不断发展，GVHD得到了越来越多的重视。肠道微生态调节在GVHD治疗中尚有很多未知的领域亟需探索。综上所述，益生元、益生菌与粪菌移植都存在小样本量的人群研究，尽管研究结果均不同程度提示调节肠道微生态对于GVHD症状或治疗结局的可能改善作用，但是缺乏严谨设计的随机对照研究。其菌株使用的时机、种类、浓度等也是目前研究没有回答的问题，尚需要基础和临床研究加以验证。