SPE净化-同位素稀释质谱法测定乳与乳制品中生物素的含量

◎ 陶大利，白 鹤，李 琴

（农业部乳品质量监督检验测试中心（哈尔滨），黑龙江 哈尔滨 150090）

生物素（Biotin）又称维生素H、维生素B7、辅酶R等，是一种水溶性B族维生素。生物素是构成羧化酶的重要辅酶[1]，参与人体内脂肪、糖类和氨基酸的代谢[2]，对于维持机体正常生理功能有重要的作用，已广泛的应用于医药、维生素制剂、饲料添加剂、运动饮料、婴幼儿配方食品等方面，同时在生物学、医学临床和发酵工业中，也等到了广泛的应用[3]。

目前有关生物素的检测很多，有文献报道的方法有微生物法[4-6]、液相色谱法[7-9]、酶联免疫法[10]、荧光免疫层析法[11]、液质联用法[12-14]。其中，液相色谱串联质谱技术已得到广泛应用，对低含量生物素样品的定量测定起到了很大的推动作用。本研究采用液相色谱串联质谱法，同时采用内标法定量，针对乳制品研究了前处理方法，适用于乳与乳制品中生物素的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相串联质谱仪（waters，TQ）、精密电子天平（梅特勒托利多，ML204）、涡旋混合器（IKA，MS3）、高速冷冻离心机（SIGMA，3-30K）、自动固相萃取仪（吉尔森，GX274）、氮吹仪（Thermo，T18010）、超纯水系统（Thermo）、HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）。

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、冰乙酸（优级纯）、生物素标准品、生物素D4标准品，所使用实验用水均为一级水。

1.2 样品前处理

1.2.1 提取

称取5 g奶粉或20 g液态乳于50 mL容量瓶中，奶粉用40 ℃水充分溶解，加入20%醋酸1 mL，混匀超声5 min，放置至室温后定容过滤，取20 mL左右滤液于50 mL离心管中，加入20 mL水饱和的正己烷，充分振荡，放入离心机5 000 r·min-1离心5 min，取10 mL下层清液，上自动固相萃取仪净化。

1.2.2 净化

分别用3 mL甲醇、3 mL一级水活化HLB固相萃取柱，取10 mL提取液上样，3 mL一级水淋洗，吹干，用3 mL甲醇洗脱，全部收集洗脱液，整个过程控制流速在 1 mL·min-1以内，加入 2 μg·mL-1生物素 D4内标溶液100 μL，45 ℃氮吹至近干，用10%乙腈水溶液10 mL溶解，如做生鲜乳可适当调整溶解液的体积，过0.22 μm滤膜，使用液质联用仪测试。

1.2.3 标准曲线配制

分别移取生物素标准溶液（500 ng·mL-1）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，分别加入2 μg·mL-1生物素D4溶液100 μL，用10%乙腈水溶液定容至刻度混匀，浓度分别为5、10、20、30、40 ng·mL-1和 50 ng·mL-1；生物素 D4内标浓度与样品相同。

1.3 仪器条件

色谱柱：BEH C1850 mm×2.1 mm，1.7 μm；流动相：0.1%甲酸水与乙腈梯度洗脱，洗脱程序见表1。毛细管电压：3.3 kV；锥孔电压：24 kV；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流量：650 L·h-1；离子源温度：150 ℃；生物素：245＞97（定性），碰撞能量27 V，245＞227（定量），碰撞能量27 V；生物素D4：249＞231，碰撞能量17 V。生物素及生物素内标选择离子谱图见图1、图2。

表1 梯度洗脱程序表

图1 生物素和生物素内标选择离子谱图

图A、B为生物素两对选择离子谱图，图C为生物素内标选择离子谱图

2 结果与分析

2.1 样品提取的选择

生物素是一种水溶性维生素，而乳制品中含有一定量的蛋白质、脂肪，所以在提取目标物的同时样品需去除蛋白质获得澄清溶液才能进行测定操作。参考国家标准GB 5009.259-2016《食品安全国家标准 食品中生物素的测定》，乳类、婴儿配方食品使用柠檬酸缓冲液或3%硫酸溶液，经121 ℃高压水解15 min提取，调酸沉淀蛋白质的方法。李菁菁[12]采用水提取，采用三氯甲烷沉淀蛋白质；王凤玲[13]采用水提取，采用盐酸调pH值沉淀蛋白质。三氯甲烷沉淀样品测试波动大重现性差，使用国标方法提取沉淀与醋酸、高氯酸、盐酸沉淀测试结果没有明显差异，而且操作繁琐，在3种酸的比较中，醋酸为弱酸，具有一定缓冲能力，不用调节pH值，只需加入固定量即可实现蛋白质沉淀，操作最为简便。最终确定以水提取，使用20%醋酸1 mL沉淀蛋白。

2.2 样品的净化

在测定乳制品中生物素，很多文献均采用沉淀蛋白质后直接上机测试，但超高效液相色谱柱填料颗粒仅有1.7μm左右，样品不净化容易造成色谱柱的污染和阻塞，影响色谱柱的寿命同时也容易造成离子源的污染增加仪器维护保养成本。本研究发现，HLB固相萃取柱对生物素有较强保留，可以有效的净化样品，测试了60、200、500 mg这3个规格的SPE柱，上样量10 mL时在60 mg SPE柱也不会过载造成损失，考虑检测成本的问题选择60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱即可实现净化。

2.3 仪器条件的选择

液相条件下在流动相的选择上，梁慧敏[14]采用乙腈-0.1%甲酸10 mmol·L-1乙酸铵；但也有采用乙腈-0.1%甲酸水溶液[15]，表明流动相中添加乙酸胺对色谱峰峰形及灵敏度没有促进作用，同时通过实验证明乙腈-0.1%甲酸水比甲醇-0.1%甲酸水灵敏度更高。

质谱条件下，生物素采用电喷雾源正离子检测方式，配制1.0 μg·mL-1的生物素标准溶液，调节毛细管电压和锥孔电压得到响应较强的质量数245作为母离子。然后对母离子进行子离子扫描，调节碰撞能量，选择响应较高的2个子离子作为定性定量离子。其中响应高质量数227的作为定量离子，另质量数97作为定性离子。优化确定适合本研究的质谱条件。

2.4 基质效应的考察

在液相色谱串联质谱的应用中基质干扰效应最为常见，且干扰程度不尽相同，在生物素的测定当中尽管对样品进行的净化，通过测试基质效应（ME）仍小于70%，基质干扰不能被忽略。消除基质效应的方法主要有对样品稀释、使用基质标、使用内标，样品稀释过多影响方法灵敏度，而生物素普遍存在于乳中，乳制品没有绝对的空白样品，无法使用基质标的方法定量。内标法一直被认为是液相色谱串联质谱技术中消除基质干扰、提高定量准确度最有效的方法，因此本方法采用基质标的方法来消除基质干扰实现准确定量。

2.5 方法的验证

2.5.1 准确度评价

用本方法参加中国检科院组织的婴幼儿配方奶粉中生物素的能力验证能，两个样品结果分别为24.5 μg/100 g和39.4 μg/100 g，Z= +0.4和+0.7，Z＜2为满意结果。用本方法测定了生鲜乳中生物素含量，结果在1.51～2.74 μg/100 g，与刘志楠[16]测定牛奶本地中生物素含量的研究结果接近。证明该方法可以准确测定乳制品中生物素的含量。

2.5.2 回收率、精密度评价

选择已知含量样品（24.0 μg/100 g）做空白样品，分别添加3个不同浓度梯度（表2）标准溶液进行测定，每个梯度做6个平行测试，3个浓度生物素平均回收率分别为93.7%、97.2%、94.7%，RSD分别为2.04%、1.91%、2.68%。表明本法精密度较好，适合乳制品中生物素的定量分析。

表2 加标回收率表

2.5.3 检出限、定量限评价

定量离子3倍信噪比（S/N）评价方法检出限，根据1.2方法处理计算得到检出限为0.3μg/100g；以10倍信噪比（S/N）得到方法定量限1.0μg/100g；检出限、定量限均低于国家标准GB 5009.259-2016。可用于含量较低的样品中生物素定量分析。

3 结论

乳制品中基质复杂，通过SPE净化有效去除样品中杂质，加入同位素内标可消除基质效应的影响同时利用质谱的高选择性，获得了稳定良好的测定结果。本实验建立了一种可以检测乳制品中生物素含量的方法，操作过程简单灵敏度高、重复性好，适合乳制品中生物素含量的测定。