外源性生物素对基于生物素-链霉亲和素化学发光技术干扰的研究进展

刘 栋，仝 慧，陈 斌，张 宁，胡 健，王晓琴

（1.铜川市人民医院检验科,陕西铜川 727000；2.西安交通大学第一附属医院检验科,西安 710061）

生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是利用1 分子亲和素可以结合4 分子生物素的特性而建立的一种放大标记技术。链霉亲合素(streptavidin)是与亲合素有类似生物学特性的一种蛋白质，由于其与固相材料的非特异性结合远少于亲合素，因此在实际应用中多采用生物素-链霉亲合素系统[1]。基于BAS 的化学发光技术（chemiluminescence immunoassay，CLIA）结合了抗原抗体反应的特异度、化学发光反应的灵敏度以及BAS 的级联放大作用，具有更高的灵敏度和稳定性，且检测线性范围更宽，被广泛用于肿瘤标志物、感染性标志物、心肌损伤标志物、各种传染病、激素、药物和核酸的检测。目前大约85% 常见的化学发光分析仪器配备了基于BAS 的检测方法[2],如罗氏、西门子、雅培、贝克曼、奥森多、希森美康等品牌的多个检测平台[3]。随着生物素的广泛应用，外源性生物素对基于BAS化学发光的干扰逐渐引起大家的重视，多个国家和组织[4-7]先后对此发布警示。有多种因素可对干扰产生不同的影响，及时准确的识别干扰并采取恰当的措施有助于减少临床误诊和漏诊。本文对这些影响因素进行综述，为临床实验室人员提供借鉴。

1 外源性生物素的来源

生物素（biotin，B）即维生素B7，又称维生素H，辅酶R，是B 族维生素中一种含硫水溶性维生素。生物素以羧化酶的辅酶形式微量存在于一切活细胞中，参与糖类、脂类和蛋白质的代谢。外源性生物素是人体摄入生物素后存在于血液中的游离生物素及其代谢产物。美国人群生物素的日常摄入量为35～70 μg/d[8]，而中国人群推荐的适宜摄入量为5～50 mg/d[9]。人群的生物素摄入量在近30年大幅度提升，这是由于生物素被广泛应用于美容、美发、美甲、控制体重、孕期营养等保健领域[10]和遗传性疾病、生物素缺乏症、多发性硬化、甲状腺功能亢进、2 型糖尿病、维生素D 中毒等的临床治疗[11]。从1986年至2000年，美国人群服用含有生物素补充剂的比例从17%上升至33%，剂量通常在100 μg/d 左右，最高可达10 000 μg/d[12]。

2 外源性生物素对基于BAS 化学发光的干扰机制

基于BAS 的化学发光通过可被测量的光信号对待测物质进行测定。可被测量的光信号由生物素标记物-待测物质-发光物质标记物-链霉亲和素磁微粒复合物产生，该复合物的多少与光信号成正比。外源性生物素对基于BAS 的化学发光干扰的机制是由于外源性生物素和试剂来源的生物素会竞争性的与链霉亲和素磁微粒(streptavidin-coated microparticles,M)结合[13]，当外源性生物素达到一定量时，反应体系中的生物素总量超过了链霉亲和素磁微粒的结合能力，导致发光物质被捕获减少[14]，光信号减弱，从而引起干扰。

3 生物素干扰的影响因素

外源性生物素对基于BAS 化学发光的干扰与多种因素相关，如反应模式[15]、检测项目[16]、检测平台[3]、反应体系中的相关要素（包括外源性生物素的量、试剂来源的生物素的量、链霉亲和素磁微粒的量）[14]等。这些因素任何一种发生改变都将对检测结果产生不同影响。

3.1 外源性生物素干扰与反应模式的关系 基于BAS 化学发光的反应模式主要有夹心法和竞争法两种，外源性生物素干扰可导致夹心法模式结果假性降低而竞争法模式假性升高[15]。这是由于待测物水平在夹心法模式下与光信号水平呈正相关，而在竞争法模式呈负相关。目前外源性生物素干扰最为常见，也最容易导致严重不良后果的情况有两种：一是在甲状腺功能检查组合中，外源性生物素干扰会导致采用夹心法模式的促甲状腺素（hyroid stimulating hormone，TSH）假性降低，而采用竞争法模式的三碘甲状原氨酸(triiodothyronine，T3）、甲状腺素(thyroxine，T4)、游离三碘甲状原氨酸(free triiodothyronine，FT3）、游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)假性升高，从而完美模拟了Graves病的实验室表现。从1996年至2016年已有多例患者由于服用生物素后检测甲状腺功能而被误诊为Graves 病[17]。二是肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）采用夹心法模式检测，外源性生物素干扰可导致检测结果严重偏低，致使急性心肌梗死患者被误认为阴性而被漏诊[18]。

3.2 外源性生物素干扰与反应体系中相关要素的关系 反应体系中的相关要素包括：外源性生物素的量，试剂来源的生物素的量和链霉亲和素磁微粒的量。当这些要素不同时，干扰的程度不同。

3.2.1 外源性生物素的量与干扰的关系：外源性生物素达到一定阈值后可使光信号假性降低，光信号的降低程度与外源性生物素的浓度呈正相关，TRAMBAS 等称之为“生物素干扰的剂量依赖性”[19]。他们在罗氏检测平台上观察了包括甲状腺功能、性激素、心肌标志物、贫血、肿瘤标志物等32 个项目（夹心法模式19 个，竞争法模式13 个）在0～1 000ng/ml 生物素添加后的结果变化曲线，发现均存在剂量依赖性。LI[13]在31 个项目中也有相同的发现（夹心法模式23 个，竞争法模式8 个）。反应体系中外源性生物素的量还与样本加样量有关，通过保持试剂组分及其他所有要素不变，仅改变样本加样量的实验显示[14]，100 ng/ml 的生物素添加样本在人绒毛膜促性腺激素β 亚基（human chorionic gonadotropin β subunit，β-HCG）测量程序（夹心法模式）中，样本加样量为10，15，20 和50μl 时，随着样本加样量的增加，光信号等比例下降；在孕酮（progesterone，Prog）测量程序（竞争法模式）中，样本加样量为15，20 和30μl 时也有相同的表现。由此可见，外源性生物素的浓度越高，样本加样量越大，干扰程度越大。

3.2.2 试剂来源的生物素的量与干扰的关系：刘栋[14]的实验显示，混合试剂，均加入10 μl 100ng/ml的生物素样本，夹心法模式在试剂加样量为70，80，110 和140μl 时，光信号的下降幅度分别为89.36%，86.42%，82.01%和77.42%；竞争法模式在试剂加样量为70 和140μl 时，光信号下降幅度分别为61.38%和41.51%。这说明反应体系中试剂来源的生物素具有抗外源性生物素干扰的作用，试剂加样量越大，抗外源性生物素干扰的能力越强。反应体系中试剂来源的生物素的量还与生物素试剂的浓度有关，因此有理由相信，试剂来源的生物素浓度越高，其抗外源性生物素干扰能力也会越强，这提示可能通过增加试剂中的生物素成分以增加抗外源性生物素的干扰。

3.2.3 链霉亲和素磁微粒的量与干扰的关系：研究显示[14]，在混合试剂模式下，夹心法模式β-HCG测量程序时，链霉亲和素磁微粒浓度为0.036 mg/ml时可抵抗不足5 ng/ml的外源性生物素干扰（-50.28%的光信号变化），而浓度为7.2 mg/ml 时可抵抗400 ng/ml 的外源性生物素干扰（-10.44%的光信号变化）；竞争法模式Prog 测量程序时，链霉亲和素磁微粒浓度为0.036 mg/ml 时可抵抗略小于5 ng/ml 的外源性生物素干扰（-14.35%的光信号变化），而浓度为7.2 mg/ml 时可抵抗约1 000 ng/ml 的外源性生物素干扰（-13.52%的光信号变化）。反应体系中链霉亲和素磁微粒的量还与其加样量有关，因此也可以推断，链霉亲和素磁微粒的加样量越大，抗生物素干扰能力也会越强。这提示也可能通过增加链霉亲和素磁微粒的浓度以提升抗外源性生物素干扰的能力。

3.3 外源性生物素干扰与不同待测项目的关系 不同项目之间抗生物素干扰的能力不同。PIKETTY等[16]报告了三种检测平台不同项目的干扰阈值：罗氏平台(Cobas，Elecsys，Modular)出现生物素干扰的浓度阈值分别为：TT3 41 nmol/L，TT4 409 nmol/L，FT3 286nmol/L，FT4 82 nmol/L，TSH 102 nmol/L，甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody，TgAb） 327 nmol/L，促甲状腺素受体抗体(thyrotropin receptor antibody，TRAb）41 nmol/L，雌二醇(estradiol，E2）147 nmol/L，卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)246 nmol/L，黄体生成素(luteinizing hormone，LH)105 nmol/L，泌乳素（prolactin，PRL）164 nmol/L，睾酮（testosterone，TESTO）123 nmol/L，C 肽（C-Peptide，CPS） 246 mnol/L，胰岛素（insulin，Ins）246 nmol/L，甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）205 nmol/L，性激素结合蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）246 nmol/L，维生素D（vitamin D，VD）286 nmol/L，促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone,ACTH）246 nmol/L，生长激素（human growth hormone,HGH）123 nmol/L。奥森多平台(Vitros)出现干扰的生物素浓度低值分别是：TSH 20.5 nmol/L，E2 20.5 nmol/L，FSH 4.1 nmol/L，LH 20.5 nmol/L，PRL 4.1 nmol/L，TESTO 4.1 nmol/L，PTH 20.5 nmol/L，VD 6.1 nmol/L。西门子平台(Dimension Vista，Exl)出现干扰的生物素浓度低值分别为：FT4 150 nmol/L，E2 150 nmol/L。相同剂量的生物素在不同项目间干扰程度也不相同。TRAMBAS[19]和评价了添加相同剂量的生物素（0 ～ 1 000ng/ml）后在罗氏平台上的32 个项目，发现其受干扰反应曲线各不相同，HASLAMS 等[3]也有相似的观察结果。也有研究发现，即使是低浓度生物素(1.5 ng/ml)也会对PRL检测结果产生显著影响[20]。根据前文所述，这主要是由于不同项目之间，其反应模式不同，反应体系中各要素的比例关系不同所致。了解每个项目的反应模式和反应体系中各要素的信息，对于准确判断和评估干扰有重要价值。

3.4 外源性生物素干扰与待测物水平的关系 外源性生物素干扰与待测物水平无关。LI 等[13]观察了HCG，β-HCG，TSH，cTnT，N-末端B 型钠尿肽前体(N-terminal pro B-type natriuretic peptide，NT-Pro-BNP）、总前列腺特异性抗原(total prostate specific antigen，TPSA)、游离前列腺特异性抗原(free prostate specific antigen，FPSA)等7 个项目各两个浓度水平，分别添加了31.25～1 000ng/ml 的生物素后，发现在同一个项目中,相同剂量的生物素对不同待测物水平所导致的干扰程度相同。结合3.2 所述内容，提示干扰程度由反应体系中样本来源和试剂来源的生物素的量与链霉亲和素磁微粒的量之间的比例关系决定，而待测物水平与这一比例关系无关。

3.5 外源性生物素干扰与检测平台的关系 不同的检测平台中，对生物素干扰的敏感度不同，受干扰项目的种类和阈值也不相同。PIKETTY 等[16]和LUONG 等[21]分别报道了目前全球范围内的7 个检测平台的抗生物素干扰能力，发现罗氏检测平台的所有项目均易受到样本来源的生物素干扰，而西门子和索灵平台抗生物素干扰的能力最强。HASLAM[3]在分别添加30，60 和500 ng/ml 的生物素后，罗氏平台不受影响的项目比例分别为100%，91%和23%，贝克曼不受影响的项目比例分别为91%，91%和86%，西门子不受影响的项目比例分别为100%，96%和91%。这种情况说明，不同的检测平台设计，反应程序设计和试剂组分设计，也有助于改善抗生物素干扰的能力。事实上，西门子公司在Centaur 平台中已经通过进行生物素试剂-链霉亲和素磁微粒的预制以消除生物素的干扰。已知采用预制模式的项目有FT4,PTH,丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒核心抗体、乙型肝炎病毒e 抗原、乙型肝炎病毒e 抗体、抗环瓜氨酸肽抗体等项目。罗氏公司于2019年开发出了一种生物素抗体，能特异性结合游离生物素，而对标记于抗体表面的生物素不结合，可作为抗干扰组分添加至反应体系中，以减少生物素干扰[22]，采用该技术的TRAb 将于2020年11月～2021年1月进入市场。

4 展望

基于BAS 化学发光的检测项目都存在外源性生物素干扰的风险。在实际应用过程中，难点在于准确、快速地评估是否存在干扰以及干扰的程度，并选择恰当的方法进行预防和验证。外源性生物素对基于BAS 化学发光的干扰受多种因素影响，了解这些因素有助于快速准确判断有无干扰及干扰的程度，选择合适的应对措施，为临床提供科学解释，减少误诊和漏诊。同时，针对这些影响因素也可能建立更好的抗生物素干扰的方法。