D-生物素合成研究进展

刘记成，房 欢，董会娜，孙玉梅，张大伟，4

（1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034；2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；3.中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308；4.中国科学院大学，北京 100049）

生物素（biotin）也可称为维生素B7，主要存在于大自然中的动植物体内，是一种维持人体正常运动所不可或缺的维生素，也是合成维生素C的必要物质。它是含3个不对称碳原子的双环化合物，共有8种同分异构体，但只有全顺式结构的D-生物素（D-biotin）才具有生理活性[1]。D-生物素的存在形式分为游离状态与结合状态，而存在于肠道中结合状态的D-生物素必须经微生物分解成游离状态才能被机体利用。最容易被吸收利用的D-生物素存在于动物的小肠中，吸收之后主要分布于心、肝和肾脏中。在猪食料中添加适量D-生物素时，会使猪的肝脏和心脏更有活力，但D-生物素添加过多时，超过自身需要的部分不会被吸收，而是随着尿液或粪便排出体外[2-3]。

D-生物素最初在酵母的研究过程中被发现，参与酵母中的氮源代谢，因此在白兰地中添加少量D-生物素可以提高酒的风味[4]，随着对其深入研究，D-生物素可逐渐应用于畜牧业、生物技术和发酵工业等多个领域。据报道，D-生物素可以促进脂肪迅速分解并转换成人体运动所需的能量，这一发现奠定了D-生物素在减肥运动类保健品中的应用。自2016年以来，国内外市场上开始畅销含D-生物素成分的保健品，进而D-生物素的价格也有所上升，这非常有利于我国D-生物素生产企业的发展[5-6]。目前全球D-生物素纯品的生产能力达到400 t/年以上，几乎全部集中于中国，占全球97%以上的市场份额。我国的圣达生物与新和成是全球最大的两家供应商，据公开资料显示，目前圣达生物的D-生物素纯品年产能为160 t，新和成的D-生物素纯品年产能为120 t。近年来，只能通过化学合成法对D-生物素进行工业化生产，但其工艺繁杂、生产成本昂贵和环境污染等问题，使广大学者开始致力于用微生物合成D-生物素的研究。基于目前生物法合成D-生物素还处于起步阶段，该文从D-生物素的生物合成途径、代谢调控以及生物合成策略等方面进行综述，以期为D-生物素高产菌株的构建提供参考。

1 D-生物素的化学合成

D-生物素的完整化学合成途径是Sternbach在1949年提出来的，因而该途径被命名为Sternbach路线。该路线的原料为富马酸，经溴代、苄胺化、环合三步反应后合成第一个关键中间体环酸；再与醋酸酐反应生成的酸酐经还原和硫代之后，获得第二个关键中间体硫酮；硫酮经格氏反应、氧化、酸化得含硫的鎓盐，最后经溴代、缩合、酸化得到终产物D-生物素[7]。Sternbach是D-生物素大规模生产的基石，之后的D-生物素工业生产途径均是以此方法为基准一步步改进的。

1999年陈芬儿等[8]报道了以氯霉素副产物右胺作为手性辅助试剂，右胺与环酸反应后被还原成内酯，进而合成D-生物素，右胺的价格在当时十分廉价，但后来因氯霉素的副作用十分严重，这使得右胺越来越不易获得。2001年CHAVAN S P等[9]报道了一条生产路线，其生产原料为L-胱氨酸，经还原、开环、硫代、强碱下烯醇化后在三甲基硅基的作用下经环化得到D-生物素骨架，最后在wittig反应下获得终产物，该路线各步反应收率很高，但合成步骤过多，且总产率并没有显著提升。2002年SEKI M等[10]报道的生产路线是以L-半胱氨酸为原料，首先经三步反应后在苄基胺和三甲基氰硅烷作用下水解生成酰胺，酰胺经缩合得到硫酮，进而产生D-生物素，该方法简化了合成路线，但原料不易获得。以上报道的D-生物素合成路线，或是生产成本较高，或是总收率偏低，均不适合应用于工业生产当中。

2002年我国新昌制药厂在合成路线上取得重大突破，将国际的11步D-生物素合成法缩减至8步，不仅简化了工艺流程，还在降低生产成本的基础上提高了D-生物素的产量，建立了第一条属于我国自己的化学合成法生产D-生物素路线[11]。2011年和2019年我国浙江新和成药业分别公开两种D-生物素合成方法，在2011年公开的方法主要解决了生产原料在和2,2-二氰基乙酸乙酯反应过程中生成副产物的问题，提高了这一步的反应效率，但总收率并没有显著提高；在2019年公开的方法是以半胱氨酸盐酸盐、苯甲醛和苄基异氰酸酯为起始原料，经9步反应生成D-生物素，该方法生产成本低且产物分离容易，是目前最适合我国工业化生产D-生物素的路线[12-13]。

由以上报道可知，化学法合成D-生物素的途径已经非常成熟，经过广大学者们的研究，其生产成本昂贵的问题基本上被解决。但化学法对环境造成污染的问题依旧无法彻底解决，另外其生产工艺流程依旧很复杂，因此加大利用生物法合成D-生物素的研究力度就显得非常重要。

2 D-生物素的生物合成

2.1 D-生物素的生物合成途径

大多数微生物都能从头合成D-生物素，且从前体物质庚二酸单酰载体蛋白（pimeloyl acyl carrier protein，Pim-ACP）或庚二酸单酰辅酶A到D-生物素的途径是基本一致的。据报道，这部分反应的大体过程为，先由7-酮基-8-氨基壬酸合成酶（BioF）催化L-丙氨酸与庚二酸单酰载体蛋白（Pim-ACP）反应生成7-酮基-8-氨基壬酸（7-keto-8-amino-pelargonic acid，KAFA），随后7,8-二氨基壬酸合成酶（BioA）将S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethiomnine，SAM）或赖氨酸上的氨基转移到KAPA上生成7,8-二氨基壬酸（7,8-diamino-pelargonic acid，DAPA），然后脱硫生物素合成酶（BioD）在CO2和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的参与下闭合脲基环DAPA生成脱硫生物素（dethiobiotin，DTB），最后DTB在生物素合成酶（BioB）和其他辅因子的作用下合成D-生物素（图1）[14-15]。它们的不同之处在于早期合成前体物质：革兰氏阴性菌在合成前体时，以大肠杆菌为代表，丙二酸单酰ACP在BioC（与D-生物素早期合成有关）作用下ω-羧基发生甲基化生成丙二酸单酰ACP甲酯，随后经过两轮脂肪酸延伸循环生成庚二酰单酰ACP甲酯，在BioH（与D-生物素早期合成有关）催化下去甲基生成庚二酸单酰ACP，最后进行D-生物素的合成；而革兰氏阳性菌，以枯草芽孢杆菌为代表，长链酰基ACP在一种细胞色素P450酶BioI催化下生成庚二酸单酰ACP，或者庚二酸在ATP依赖的BioI酶催化下生成庚二酸单酰辅酶A，然后庚二酸单酰ACP或庚二酸单酰辅酶A作为前体生成D-生物素（图1）[16-17]。近期，SAKAKI K等[18]研究发现Synechocystissp.PCC 6803在缺失了bioA基因的情况下仍然可以产生D-生物素，研究人员对此进行了生物信息分析等一系列实验，最终发现了一种新型多功能脱氢酶BioU的存在，BioU除了可以代替BioA，还具有BioD的一些功能，并且在整个反应结束后会失去催化活性，这一发现为D-生物素的生物合成提供了一个新的思路。

图1 D-生物素合成途径Fig.1 Biosynthetic pathway of D-biotin

2.2 D-生物素生物合成操纵子的调节机制

在动物体内，D-生物素通过将生物素环束缚在蛋白质上的长链的帮助下，可在具有酶活的部位上接受羧基，之后释放给底物受体，进而可以参与体内一系列羧化反应。在原核生物中，生物素连接酶也叫BirA蛋白，在D-生物素生物合成操纵子的转录过程中进行负调控。当胞内的D-生物素积累超过一定量的时候，BirA蛋白会与生物素中间体（生物素-5-单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）结合形成配体，之后再与生物素操纵子结合，最终会阻遏生物素操纵子基因的表达；当胞内的D-生物素积累量降低时，酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）转移到乙酰辅酶A羧化酶的亚基（AccB受体蛋白）上，BirA蛋白不与生物素-5-AMP结合，进而相关基因开始进行转录表达；而当细胞内的乙酰辅酶A羧化酶的另一个亚基-AccC蛋白过量时，AccB与AccC蛋白便会形成一个复合结构体，从而酰基载体（ACP）无法与AccB蛋白结合，此时BirA蛋白又与biotinoyl-5-AMP结合成配体，导致其基因的表达被阻遏[19]。解决这个基因表达被阻遏的问题可成为研究者们提高微生物合成D-生物素产量的一种手段。

BirA蛋白在生物素-亲和素的研究中也起到十分重要的作用，该研究中的BirA蛋白均来自于原核生物。生物素与亲和素/链酶亲和素有高度的亲和性，可形成十分稳定的缔合体，是蛋白质-生物小分子体系中结合自由能较强的体系。生物素-亲和素/链酶亲和素体系具有高度的稳定性，在中性条件下的解离常数为10～15 mol/L，远高于其他的配体-受体作用。两个体系可以偶联蛋白质、核酸和酶等活性物质，还能结合固体材料，并且一个蛋白质分子上可以结合多个生物素分子，同时一个亲和素也可以结合4个生物素分子，因此生物素-亲和素体系还可起到多级放大的作用。生物素-亲和素/链酶亲和素体系的这些作用，使得其在诊断分析和蛋白质工程等方面得到广泛应用[20]。

2.3 微生物合成D-生物素的研究进展

大多数的微生物都可以用来生产D-生物素，但其原始菌株的生产能力都不高，因此需要根据代谢工程理论，对D-生物素生产菌株通过现代生物技术手段来提高产量。研究者们主要通过对D-生物素生产菌株进行抗性筛选、导入人工改进的生物素操纵子、提高某些辅助因子含量、增强有用的基因以及敲除不利基因等手段来提高微生物合成D-生物素的产量。目前研究的最新成果见表1。

表1 通过代谢控制及基因工程方法构建D-生物素高产菌的研究进展Table 1 Research progress of high yield D-biotin microbes constructed by metabolic control and genetic engineering

2.3.1 代谢控制育种

提高D-生物素产量的首要条件就是筛选优良的微生物菌种，由D-生物素生物合成途径可知，SAM参与了其中的多个反应，因此通过代谢途径控制提高发酵过程中SAM的供应量，是获得高产D-生物素菌株的较好的方法。KANZAKI N等[21]对大肠菌株进行β-羟基正缬氨酸抗性筛选，得到了一株突变体E.coliANA91/pXBRP319，其原理是通过提高细胞体内的甲硫氨酸水平从而增加氨基酸供体的数量，最终增强了工程菌株产D-生物素的能力，其生产能力达970 mg/L，这是目前国内外用大肠杆菌产D-生物素的最高产量。林建平等[22]通过B.subtilis168中bioW基因序列和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ZJU001中S-腺苷-甲硫氨酸合成酶基因（sam2）序列来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA对生物素的合成，用E.coliBL21（DE3）为产生菌在以庚二酸为底物的培养基中进行补料发酵，D-生物素产量提高了200倍，达到417 mg/L，这是现阶段我国用大肠杆菌产D-生物素的最高产量。达雄星野等[23]对库特氏菌538-6的酸霉素、5-（2-噻吩基）-戊酸和脱硫生物素抗性进行筛选，得到库特氏菌属538-2A13，用FM1培养基发酵，将D-生物素产量由0提高到126 mg/L。SAKURAI N等[24]对粘质沙雷菌进行放线噻唑酸抗性进行筛选，得到了菌株S.marcescensSB412，之后使菌株突变对乙硫氨酸和S-2-氨基乙基半胱氨酸产生抗性，从而获得菌株ETA 23，再以携带parB位点的pLGM304P作为载体来过表达全部bio基因，最后对其进行高密度培养，D-生物素最高可积累到500 mg/L。金学明等[25]从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买一株掷孢酵母，经诱变获得S.cesrosellsHK301，之后在发酵过程中对其进行碳源、氮源以及金属离子优化，最终D-生物素产量提高一倍，达到540 mg/L。

2.3.2 基因工程育种

基因工程育种可通过在D-生物素代谢途径中敲除某些对产物有抑制作用的基因或加强有用基因的表达来提高D-生物素的表达量，这是现阶段最有发展的一种育种方法。GLOECKLER R等[26]从B.sphaericusIFO3525菌株中扩增出生物素操纵子bioXWF基因，构建出PTG3405质粒，并用trp为载体转化到E.coliC258中，对其进行发酵培养，D-生物素产量可达150 mg/L。BOWE R等[27]用高生物素和α-脱氢生物素来筛选枯草芽孢杆菌生物素类似物抗性的突变菌株，其原理是bioA基因位点的某个氨基酸序列发生突变，之后将筛选成功菌株的所有bio基因进行过表达，得到菌株B.subtilisBI282，最终以SAM为氨基酸供体用VY培养基对菌株进行发酵，维生素总产量达到了600 mg/L，但其中D-生物素产量却只有6 mg/L。之后VAN ARSDELL S W等[28]对B.subtilisBI282进行了研究，发现L-赖氨酸比SAM更适合作为枯草芽孢杆菌的氨基酸供体，用L-赖氨酸作氨基酸供体进行发酵的D-生物素产量可达21 mg/L，尽管如此，其D-生物素产量依旧不高。由此可知，对于枯草芽孢杆菌来说，合成D-生物素的最后一步仍然是个瓶颈。SHAW N M等[29]将经修饰的大肠杆菌中的生物素操纵子bioBFCDA连接到pB047上，将构建出质粒Pbo30A-15/9转化到Agrobacterium/RhizobiumHK4中，上罐发酵最高可产生110 mg/LD-生物素。XIAO F等[30]对异变假单胞菌进行了过表达合成途径中的限速酶编码基因，敲除负调控因子，增强辅因子的供应以及引入枯草芽孢杆菌的BioW-BioI途径这四级代谢工程改造，之后以甘油为碳源将改造好的菌株进行发酵，D-生物素最高产量为272 mg/L，这也是目前除粘质沙雷菌和大肠杆菌外产量最高的D-生物素生产菌株。

由以上报道可知，近年来微生物合成D-生物素的发展十分迅速，但尽管如此，生物法依旧无法与化学法竞争。主要原因还是产量达不到工业化的要求，其中D-生物素生物合成途径的脱硫生物素到D-生物素是限速步骤，这一过程是由BioB催化的，BioB是一个催化速度很慢的酶（Kcat=0.12 min-1），而过度表达bioB基因还会抑制生物素的转化[31]。这一步反应依赖氨基酸供体，研究表明，枯草芽孢杆菌的氨基酸供体为L-赖氨酸，其他D-生物素产生菌为SAM。氢键可连接BioB保守模体上的天冬酰胺残基（Asn153）和天冬氨酸残基（Asp155）与氨基酸供体和脱硫生物素，并与结合在BioB上的[4Fe-4S]2+和[2Fe-2S]2+形成一个类似三角体的结构，其中[4Fe-4S]2+可促进氨基酸供体还原性裂解，而[2Fe-2S]2+可为脱硫生物素形成D-生物素提供硫原子，因此对Fe-S簇的研究是提高BioB 酶活的关键[32-33]。同时在构建D-生物素高产菌株的过程中，重组载体质粒构建的稳定性也是D-生物素生物合成的一个瓶颈，过表达参合其生物合成的关键基因却导致生物素产物生成受抑制的机理也要深入研究，此外注意带有毒性的副产物生成也是重中之重。

3 展望

目前，研究者们正在利用现代生物技术手段来攻克D-生物素生物合成中的瓶颈，尤其是近年来生物信息学以及蛋白质工程的发展十分迅速，可以通过各种计算机软件对关键基因进行深入分析以及计算辅助提高酶的活性[34]，如对bioB基因进行深入分析，并以CRISPR/Cas9基因编辑技术为支撑，可以通过对bioB基因碱基序列的改变来减少密码子的使用频率，再利用量子化学计算等操作提高BioB酶的酶活，进而解决脱硫生物素转化为D-生物素效率低这一瓶颈。随着生物技术的进步，相信很快可以得到D-生物素高产菌株，以生物法完全代替化学合成，实现D-生物素的绿色生产。