原核生物中生物素代谢调控因子研究进展

陈昱宏，吴 杭，张部昌

(安徽大学 物质科学与信息技术研究院 生命科学学院，合肥 230601)

生物素(也称维生素H或B7)是一种重要的微量营养素，可作为生物素依赖性酶(生物素依赖性羧化酶、脱羧酶和转羧酶)的辅助因子，它通过共价键与赖氨酸残基相连，参与脂肪酸合成、氨基酸代谢和糖异生等代谢过程[1-2]。原核生物通常通过外界摄取或自身合成两种途径获得生物素，但部分原核生物(生物素营养缺陷型)体内不具有完整的生物素代谢途径，因此只能摄取外界生物素[3-4]。原核生物中常见的生物素依赖性酶有丙酮酸羧化酶[5]和丙酰辅酶A羧化酶[6]等。在大肠杆菌(Escherichiacoli)中，存在单一的生物素依赖性酶，即乙酰辅酶A羧化酶，催化脂肪酸生物合成途径的第一步[7-8]。当缺乏生物素时，细胞活力降低，甚至导致死亡[9-10]。而生物素充足时，细胞内代谢过程加快，产生大量的代谢产物[4]。

在多数原核生物中，编码生物素的生物合成酶基因通常聚集成操纵子[11]，这些基因具有较高的保守性,见图1(a)[2,12]。目前，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的生物素合成途径研究比较深入，大体分为庚二酰-CoA的合成和双环的组装两个部分[2]。如图1(b)所示，庚二酰-CoA的合成途径主要分为两种，包括以大肠杆菌为代表的BioC-BioH途径[13-14]和以枯草芽孢杆菌为代表的BioI-BioW途径[15-16]。有些原核微生物进化出BioV[17]、BioZ[18]等，可代替BioH的功能。而双环的组装相对保守[2]，其过程近年来也逐渐被揭示[1-2]。7-酮基-8-氨基壬酸(KAPA)是该过程的第一个中间产物，由7-酮基-8-氨基壬酸合酶(BioF)将L-丙氨酸组装到庚二酰-CoA而成。7,8-二氨基壬酸合成酶(BioA)可使SAM的氨基转移至KAPA，从而生成7,8-二氨基壬酸(DAPA)。脱硫生物素合成酶(BioD)催化脲基环闭合，形成脱硫生物素(DTB)后，由生物素合成酶(BioB)催化噻吩杂环的闭合，形成生物素(Biotin)。最近也有报道BioU代替BioA发挥功能的情况[19]。生物素的生物合成不仅需要上述4种酶的参与，还需消耗20个ATP，是一个高耗能的过程[20-22]。鉴于生物素从头合成成本较高，因此需要严格控制生物素生物合成酶的转录。目前发现原核生物中存在多种类型的调控因子，可参与控制生物素的代谢过程。本文根据已有报道对调控因子类型、分布及生物学功能进行综述。

(a)不同微生物中生物素合成基因分布示意图；(b)微生物中生物素合成的过程

1 生物素代谢调控因子的类型

目前研究显示，原核生物中生物素代谢的调控因子主要有3种类型：BirA、BioR和BioQ。最早发现的生物素调控因子是BirA[11]，它由生物素蛋白连接酶(Biotin Protein Ligase，BPL)和DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)两部分组成，因此BirA既是转录调控因子又是负责蛋白质生物素化的酶[3]。迄今已在金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[23]和超嗜热古菌(PyrococcushorikoshiiOT3)[24]等原核生物中解析了BirA蛋白的结构，发现所有BirA都具有BPL，但只有部分BirA具有DBD[9](图2)。基于此，研究人员将BirA分为两种类型。

图2 原核生物中3种类型的生物素代谢调控因子

Ⅰ型BirA的N-末端缺失DBD，仅由蛋白质生物素化所需的保守催化模块组成。因此生物素生物合成的转录调控必须由其他调控因子完成。在α-变形菌中，GntR家族转录调控因子BioR可替代BirA行使其转录调控作用[25]。而在放线菌中，TetR家族转录调控因子BioQ可充当BirA的DBD[4, 20]。BirA与BioR/BioQ之间似乎可通过某种信息交流相互影响(图2)，进而影响生物素代谢，但其作用机理至今尚不清楚。Ⅱ型BirA同时含有BPL和DBD，具有生物素连接酶和转录抑制子活性，因此是一种双功能蛋白。该类BirA存在于γ-变形菌、芽孢杆菌及各种古菌等原核生物中。在Ⅱ型BirA中，大肠杆菌的BirA被广泛研究，已经成为BirA结构、遗传和生物物理学研究的主要对象[26-27]。

2 生物素代谢调控因子的功能

2.1 BirA的双功能

BirA催化蛋白质生物素化是通过两步反应实现的[9]，BPL含有两个保守的结构催化核心，负责生物素-5′-AMP的合成和蛋白质生物素化[28]。在第一部分反应中，生物素和ATP形成生物素-5′-AMP(Holo-BirA)。在含有Ⅱ型BirA的原核生物中，Holo-BirA具有两种不同的命运[29-30](图3)。一方面，Holo-BirA可以二聚化并结合DNA，起生物素生物合成操纵子的转录因子的作用，从而抑制生物素的合成。Satiaputra等[23]在金黄色葡萄球菌中还发现，BirA(或Holo-BirA)可先以单体的形式结合到DNA上，再进行二聚化。另一方面，Holo-BirA中的BPL可以识别并靶向结合生物素羧基载体蛋白(BCCP)上的赖氨酸残基，使蛋白质生物素化。蛋白质生物素化是精准且特异的，如大肠杆菌的BirA仅修饰4 000种蛋白中的一种[31]。不同生物的BPL和BCCP通常可以相互结合[32]。这表明生物进化过程中BPL的催化机制以及酶与底物之间的蛋白质相互作用都高度保守[33-35]。

图3 BirA的双功能

目前有两种关于Holo-BirA功能选择的假说(图4)。Pendini和Weaver等[36-37]认为，当存在过量的BCCP时，Holo-BirA将优先结合BCCP，从而阻止了Holo-BirA二聚化；当BCCP浓度低时，Holo-BirA会积累并二聚化，导致DNA结合并随后抑制转录，在该模型中，Holo-BirA的功能转换是由Holo-BirA和BCCP的相互竞争导致。但Solbiati等[38]认为这种竞争并不是Holo-BirA功能选择的关键，他们认为BCCP与Holo-BirA具有更强的亲和力，BCCP可以酶底物的形式解除Holo-BirA的二聚化，使其发挥生物素蛋白连接酶功能。酶与底物的反应是短暂的，当BCCP与Holo-BirA分开后，Holo-BirA以单体形式存在，而单体Holo-BirA积累后易发生二聚化，从而发挥转录阻遏功能。

图4 BirA的功能选择

2.2 BioR的调控功能

对α-变形菌基因组序列的生物信息学分析表明，这些原核生物生物素的合成受BioR调控[25]。同时，在生物素转运蛋白bioY基因的上游发现了BioR的DNA识别序列。在布鲁氏杆菌(Brucellamelitensis)和脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)中，bioR基因的启动子区发现了BioR识别序列[22, 39]，证明BioR具有BirA所没有的自我调控特征，但根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中bioR基因的上游不存在BioR识别序列[21]，因此这种调控并不完全保守(图5)。

图5 不同α-变形菌中BioR的识别位点

Feng等[21-22]进一步研究了BioR在生物素合成中的调控作用，除了结合自身基因的识别序列外，根瘤农杆菌的BioR还能与其他菌的DNA序列结合[21]。而布鲁氏杆菌的BioR能够在体内抑制根瘤农杆菌bioB的表达[22]。这表明BioR在α-变形菌中具有较高的保守性[9]。根瘤农杆菌中，BioR只能结合bioB启动子区的识别位点，对生物素合成基因的转录起到抑制功能[21]。而在布鲁氏杆菌中，BioR识别序列位于编码bioR和bioY的上游，实验表明BioR不仅具有自我调控功能，还可介导生物素转运蛋白的表达[22]。同时，bioBFDAZ操纵子的上游也存在两个BioR识别位点，实验证实BioR对其具有转录抑制功能[22]。这些结果说明BioR介导的生物素代谢具有复杂调控方式。

在脱氮副球菌中，发现了两个BioR同源物，分别称为BioR1(Pden_1431)和BioR2(Pden_2922)[39]，并发现该菌基因组中存在6个BioR结合位点，其中两个bioR启动子区各有一个位点，两个生物素代谢操纵子(bioBFDAGC和bioYB)启动子区各有两个串联的位点。BioR1和BioR2可以共同调控生物素的合成和转运，同时它们之间也可以相互调控与自我调控[39]。外源添加生物素刺激了bioYB的表达，同时抑制了bioBFDAGC的转录，这同样表明BioR调控生物素代谢基因的复杂性[39]。

从BioR中完全去除或添加生物素对其体外DNA结合没有影响，说明生物素并不是BioR的配体[21-22]，而发现各种生物素代谢中间产物，也不是BioR的配体[22, 39]。因此，BioR配体可能要在生物素代谢的上下游中寻找。

2.3 BioQ的调控功能

放线菌中生物素代谢的调控模式类似于α-变形菌，但是由BioQ行使调控功能。在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中，生物素合成途径不完整，从而使其生物素营养缺陷。但是，在谷氨酸棒杆菌中发现一种TFR(BioQ)，可以调控生物素代谢[4]。Brune等[4]通过生物信息学分析，在谷氨酸棒状杆菌中定位了bioQ基因和生物素合成基因，发现bioQ和生物素转运蛋白(BioY)基因启动子中均含有BioQ的识别序列(图6)，并实验证实BioQ可调控这两个基因的表达，这表明该转录因子具有自我调控功能，同时对生物素的转运也具有调控作用，这对于生物素营养缺陷型谷氨酸棒杆菌至关重要。

在耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)中，BioQ的识别位点位于bioF和bioQ/B基因的上游(图6)，实验证实BioQ可抑制生物素代谢基因的转录，同时具有自我调控功能[20]。此外，生物素水平的增加导致野生型细菌生物素生物合成基因bioF、bioD和bioB的表达降低，说明BioQ对生物素浓度具有感知能力。Yan等[40]对该BioQ的蛋白结构进行解析，确定了BioQ与DNA探针结合的关键氨基酸(R27A和Y41A)，同时发现BioQ保守结合序列(5′-TGAACnnnGTTCA-3′)中任何碱基的改变都会影响BioQ的靶DNA结合能力。

图6 不同放线菌中BioQ的识别位点

研究发现，生物素及其代谢途径中产物均不是BioQ的配体[20]，但丙酸和乙酰磷酸(AcP)似乎可以影响BioQ与靶基因的结合[41-42]，这表明BioQ配体的研究也应往生物素代谢的上下游寻找。

3 总结与展望

目前原核生物中已发现3种类型的生物素代谢调控因子(BirA、BioR和BioQ)，可控制不同原核生物中生物素的合成、转运及利用等代谢过程，而不同物种的同一种类型调控因子存在交互调控作用，这表明生物素的代谢途径较为保守。目前仅发现一例多拷贝BioR共同调控生物素代谢基因，即来源于脱氮副球菌的双拷贝BioR[39]，这进一步展现了原核生物中生物素代谢的多元调控网络。

近年来，原核生物中生物素代谢调控因子的研究已逐步深入，但还有很多问题亟待解决。在含有I型BirA的生物体中，BioR(或BioQ)可替代BirA发挥调控作用，但它们与BirA之间的联系还不清楚。BioQ相较其他TetR家族调控因子，其C端配体结合结构域较为柔性[40]，暗示其可能存在多种配体，但迄今尚未见到相关研究报道。近期发现，BioQ的乙酰化修饰可影响其DNA结合能力，证实蛋白翻译后修饰对BioQ发挥调控功能至关重要[41]，但其复杂的分子机制有待进一步探索。相信随着相关功能研究的进一步深入并对上述问题进行解答，将有助于理解原核生物中生物素代谢调控的复杂网络，为新型药物靶点鉴定、合成生物学元件开发以及代谢产物水平提高等奠定理论基础。