HPLC同时测定熟肉制品中8种合成着色剂

徐 滨，柳庆坤，徐学珊*

（1. 泰安市食品药品检验检测中心，山东 泰安 271000；2. 泰安市中心医院， 山东 泰安 271000）

常用的食品色素包括两类：天然色素和人工合成着色剂。天然色素主要由植物组织中提取，对人体无毒性[1]。人工合成色素多以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经一系列有机合成反应而成，相对于天然色素，它色泽鲜艳、性质稳定、着色力强、价格低廉，成为食品行业常用的添加剂之一[2-3]。若过量添加或长期食用人工合成着色剂对人体健康会造成严重危害，严重者甚至会致癌、致畸[4]。

目前，测定人工合成着色剂的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[2-6]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[7]。本文采用HPLC-紫外检测器，同时测定柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红8种人工合成着色剂。优化前处理方法，减少干扰物对实验结果的影响，结果准确可靠，适用于大批量、多批次熟肉制品中人工合成着色剂的检测。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（SPD-20AB型泵、SPD-20A型紫外检测器、CTO-20A柱温箱、LC Solution液相色谱数据工作站，日本岛津）；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦）；SHIMADZU Wondasil C18-WR色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本岛津）；AB104-S电子分析天平（瑞士，Mettler Toledo）；TG16-WS离心机（上海卢湘仪离心机仪器公司）；DPS-20均质器（美国PRO）；KQ-600DE型超声仪（昆山超声仪器公司）；Essential超纯水仪（密理博中国）；G3垂容漏斗（天津玻璃仪器厂）；50 ml刻度离心管（美国康宁）；绞肉机（九阳公司）。

1.2 材料

100～200目聚酰胺粉（浙江台州路桥四甲生化塑料厂）；0.45 μm微孔滤膜（上海安谱公司）；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔公司）；乙酸铵（色谱纯，赛默飞世尔公司）；无水乙醇（分析纯，天津百世）；氨水（分析纯，国药集团）；柠檬酸（分析纯，天津永大）；甲酸（分析纯，成都科龙）；石油醚（分析纯，国药集团）；亚铁氰化钾（分析纯，天津永大）；乙酸锌（分析纯，天津永大）；纯化水。标准品储备液见表1。

表1 8种色素对照品储备液

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别取表1中标准储备液各适量，用水稀释成浓度分别为 1，5，10，15，20，25 μg/ml的系列混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取熟肉样品，经绞肉机充分搅匀，取约2.0 g样品，精密称定，置入50 ml刻度离心管，加温水约30 ml，均质1 min，超声20 min。加入5 ml亚铁氰化钾溶液（92 g/L）和5 ml乙酸锌溶液（183 g/L）溶液，温水定容至50 ml，充分混匀，静置10 min。5000 r/min高速离心10 min，取出上层液，加温水多次提取至无色，合并上层液于分液漏斗中，加50 ml石油醚萃取3次，取下层液加柠檬酸溶液（0.2 g/ml）调节pH 4，作为试样溶液。取1 g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液，快速搅拌，如果溶液还有颜色再添加少许聚酰胺粉，至溶液近无色，用G3垂熔漏斗抽滤，用 pH 4（水加柠檬酸溶液调pH 4）的水洗3次，每次20 ml，用甲醇-甲酸混合溶液（6:4）洗3次，每次10 ml，再用水洗至中性，用无水乙醇-氨水-水混合溶液（7:2:1）洗3次，每次5 ml，收集解吸液，加乙酸调节pH值至7，蒸发至近干，加水溶解，定容于5 ml，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-乙酸铵溶液（0.02 mol/L）为流动相，梯度洗脱，程序见表2；流速为1.0 ml/min；进样体积为10 μl；柱温为30 ℃；检测波长为254 nm。取混合对照品溶液10 μl注入高效液相色谱仪，理论板数以柠檬黄的峰计算不低于7813，柠檬黄与新红的分离度大于2。混合对照品溶液（浓度为15 μg/ml）的色谱图见图1。

表2 流动相梯度洗脱程序

图1 混合对照品溶液的色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线与线性范围考察 在3.2项色谱条件下，取系列混合对照品溶液注入液相色谱仪，得到峰面积（Y）与浓度（X）间的标准曲线，见表3。由表3可见各合成着色剂浓度与峰面积线性关系良好，线性范围为1～25 μg/ml，相关系数r＞0.99994 。

表3 各合成着色剂保留时间、回归方程、相关系数和线性范围

2.3.2 检出限试验 以3倍基线噪音的峰高相当的合成着色剂的量计算检出限，柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红的检出限分别为0.02，0.028，0.012，0.008，0.016，0.012，0.012，0.008 μg/ml。

2.3.3 重复性试验 精密称取熟肉样品，加入一定量的混合对照品溶液，制成模拟阳性样品，进样6次，重复性良好，结果见表4。

表4 重复性试验（n=6）

2.3.4 回收率试验 取3种已知8种合成着色剂含量的不同熟肉制品各3份，每份2.000 g，分别加入8种混合标准溶液20，40，60 μg，按本法处理，进行测定，计算加标回收率和RSD，结果见表5。RSD值在0.32%～2.12%之间，加标回收率在83.0%～97.9%之间，符合食品检验要求。

表5 方法回收率试验结果（n=3）

2.4 样品测定

采用此测定方法对110批次的熟肉制品（包括香肠、烤鸭、烧鸡、猪头肉、风干肉、肉罐头等）进行了检测，部分熟肉制品中检出了柠檬黄和日落黄，含量分别为3.225 mg/kg、5.165 mg/kg，阳性样品图谱见图2。

图2 阳性样品溶液色谱图

3 讨论

3.1 样品处理条件优化

熟肉制品中含大量蛋白质和脂肪，样品处理中加入蛋白沉淀剂（亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液）去蛋白质，用石油醚萃取脂肪，达到净化效果，有效减少254 nm检测波长处干扰峰的出现，提高了结果的准确性。

3.2 色谱柱的选择

分别用SHIMADZU Wondasil C18-WR和Agilent ZORBAX SB-C18两种C18柱对8种混合合成着色剂标准溶液进行相同条件的梯度洗脱，由于柠檬黄和新红两种合成着色剂的保留时间非常接近，SHIMADZU Wondasil C18-WR色谱柱不能将两色谱峰彻底分开，合并重叠形成一个色谱峰。使用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，8种合成着色剂分离效果良好，且出峰时间早，缩短了分析检测时间。

本实验方法采用梯度洗脱，在254 nm波长下同时测定8种合成着色剂，方法稳定，线性范围良好，灵敏度高，受杂质峰的干扰较小，各峰之间分离度好，能满足日常熟肉制品中人工合成着色剂的检验要求，具有重要的实际应用价值。