HPLC同时测定复肝宁片中芍药苷和绿原酸的含量

梁惠明，彭 敏，吕琼芳，汤艳群，谭洁英*

（1. 江门市药品检验所，广东 江门 529030；2. 广东省江门市新会区人民医院药剂科，广东 江门 529100）

复肝宁片是本地制药企业生产的口服制剂，由板蓝根、麦芽（炒）、柴胡、牡丹皮、山楂、金银花、六神曲（炒）七味药材组成。具有舒肝健脾，清热利湿之功效，用于乙型肝炎表面抗原阳性属于肝旺脾虚，热毒较盛者[1]，临床应用广泛。现行的质量标准为《卫生部药品标准》中药成方制剂第四册，该标准中未有含量测定部分。牡丹皮和金银花均为复肝宁片的重要组分，牡丹皮为毛莨科植物牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的干燥根皮，具有清热凉血，活血化瘀之功效[2]，主要成分为芍药苷等[3]。金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒，疏散风热之功效[4]，绿原酸是其主要活性成分之一[5]。为了提高药品质量标准，本文建立了高效液相色谱法（HPLC）同时测定牡丹皮中芍药苷和金银花中绿原酸的含量，该方法简便、快速，准确，重现性好，可作为复肝宁片质量控制的有效方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪（LC-20AT 高压泵，SPD-M20A 二极管阵列检测器，SIL-20A 自动进样器，日本岛津公司）； XS205DU电子分析天平（METTLER TOLEDO）；KQ-300DE型台式数控超声波清洗器（东莞科桥）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号110736-201438，含量96.4%，中国食品药品检定研究院）；绿原酸对照品（批号 110753-201314，含量96.6%，中国食品药品检定研究院）；复肝宁片（批号：170601、170602、170603，本地某制药企业）；缺牡丹皮阴性样品、缺金银花阴性样品均由本地制药企业提供。乙腈为色谱纯（HPLC级，Honeywell）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈- [（水- 磷酸-三乙胺（85:0.08:0.08 ）]（17:83）；流速1.0 ml/min；芍药苷检测波长230 nm，绿原酸检测波长327 nm；柱温35 ℃，进样量10 μl。理论板数按芍药苷峰计算不低于5000。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取芍药苷对照品及绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 ml约含芍药苷26 µg、绿原酸150 µg混合溶液，作为对照品溶液；另取芍药苷对照品、绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇分别制成每1 ml约含芍药苷26 µg、绿原酸150 µg溶液，作为专属性试验用芍药苷对照品溶液及绿原酸对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取2片的量，精密称定，置20 ml量瓶，加50%甲醇适量，超声处理（功率300 W，频率33 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.2.3 阴性样品溶液的制备 分别取缺牡丹皮阴性样品、缺金银花阴性样品按 2.2.2项下供试品溶液制备方法制备缺牡丹皮阴性样品溶液和缺金银花阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

分别精密吸取芍药苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液、供试品溶液、缺牡丹皮阴性样品溶液、缺金银花阴性样品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1；供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而缺牡丹皮阴性样品溶液及缺金银花阴性样品溶液在此保留时间处无干扰。

2.4 线性关系考察

精密称取芍药苷对照品适量，用50%甲醇制成含芍药苷2.328 mg/ml对照品储备液，分别精密量取储备液0.5，1，2.5 ml置200 ml量瓶，再精密量取储备液0.5，0.75，1 ml置20 ml量瓶，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成芍药苷对照品系列溶液；另精密称取绿原酸对照品适量，用50%甲醇制成含绿原酸5.878 mg/ml对照品储备液，分别精密量取储备液0.1，0.2，0.5，1，1.5，2 ml置20 ml量瓶，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成绿原酸对照品系列溶液。按2.1项下色谱条件进样，测定峰面积。以峰面积A值为纵坐标Y，分别以芍药苷对照品和绿原酸对照品的浓度C（mg/ml）为横坐标X，计算回归方程。结果表明：芍药苷在0.00582～0.1164 mg/ml范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=1×106X-11 973，r=0.9999；绿原酸在0.02939～0.5878 mg/ml范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=3×106X-46 247，r=1.0000。

2.5 回收率试验

取本品（批号为170601，平均片重0.2883 g，每片含芍药苷0.2863 mg、含绿原酸1.4825 mg）约1片重，共9份，精密称定，置20 ml量瓶，分别精密加入对照品混合溶液（含芍药苷0.1271 mg/ml，含绿原酸0.7791 mg/ml）1，2，3 ml各3份，依2.2.2项方法制得供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，计算回收率（结果见表1、表2），结果芍药苷平均回收率为98.55%，RSD=1.98% （n=9），绿原酸平均回收率96.92%，RSD=1.63%（n=9），结果表明，方法准确度较好。

表1 芍药苷回收率试验结果

2.6 精密度

2.6.1 重复性试验 取同一批样品，依2.2.2项方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，记录峰面积。经计算芍药苷平均含量为0.2863 mg/片，RSD为 1.25%（n=6）；绿原酸平均含量为1.4825 mg/片，RSD为 1.84%（n=6）。结果表明，方法的重复性良好。

2.6.2 仪器精密度试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。计算芍药苷、绿原酸峰面积的RSD分别为 0.25%，0.47%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，24 h测定峰面积，计算芍药苷及绿原酸峰面积RSD分别为0.79%，0.81%。结果表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 样品测定

取本品3批，按照2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，按外标法计算各组分的含量，结果见表3。

表3 含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长选择

利用二极管阵列检测器对两个对照品进行紫外光谱扫描，发现芍药苷、绿原酸分别在230 nm、327 nm处有最大吸收，芍药苷在327 nm处几乎无吸收，而绿原酸在230 nm处有部分吸收，但干扰较大，为更准确、稳定检测目标成分，故选择230 nm为芍药苷检测波长，327 nm为绿原酸检测波长。

3.2 多个因素考察

3.2.1 流动相的选择 试用了不同比例的乙腈-水、乙腈-酸水及乙腈-酸水-三乙胺3种流动相，结果以乙腈- [（水- 磷酸-三乙胺（85:0.08:0.08 ）]（17:83）为流动相时分离效果最好。

3.2.2 提取溶剂的选择 考察了水、乙醇、甲醇、50%甲醇的提取效果，结果以50%甲醇为溶剂提取效果最佳。

3.2.3 提取方法选择 考察了超声法和加热回流法，结果差异不大，超声法更简便，故选择超声法提取。

3.2.4 提取时间确定 以50%甲醇为溶剂，分别超声处理10，20，30，50 min，结果提取时间为30 min比10 min、20 min含量高，而与提取时间为50min的含量差异不大，故选择提取时间为30min。

3.3 经查阅文献，杨芳[6]等用HPLC测定复肝宁片中绿原酸的含量及黄有带等[7]用HPLC测定该制剂中柴胡皂苷a的含量。本研究建立的HPLC在同一色谱条件下，分别以两个波长同时测定该制剂中两种有效成分的含量，实现多指标控制产品质量，为完善复肝宁片质量标准提供了参考，更有利于企业及监管部门对产品进行有效评价及监控。