皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞凋亡及端粒酶的影响

张 妍 阮连国 曾友玲 曾 洁

(武汉市妇女儿童医疗保健中心，湖北 武汉 430032)

皂荚是常用抗癌中草药之一，临床可用于乳腺癌、宫颈癌、肝癌等的治疗。研究显示，皂荚提取物浓缩液对血液系统肿瘤、前列腺癌、乳腺癌等癌细胞的生长具有一定的抑制作用〔1，2〕。目前为止，皂荚提取物对宫颈癌的抑制作用及其机制国内外暂无相关报道。本实验旨在探讨皂荚提取物对人宫颈癌Hela细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人宫颈癌Hela细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。皂荚提取物由广州中医药大学中药学院提供，皂荚生药浓度为2.0 g/ml。Bcl-2单抗、Bax单抗、p53超敏S-P(鼠)试剂盒(Gibco公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Hyclone公司)，TIANampGenmic基因组DNA提取试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)，PCR-ELISA端粒酶试剂盒(福建迈新公司)，EPICSELTE ESP型流式细胞仪(美国COUITER公司)，LH50A型倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)，酶标仪器(美国Bio-Rad公司)、TC2323型CO2培养箱(美国SHELDON公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人宫颈癌Hela细胞复苏后，接种于RPMI1640完全培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，实验在细胞对数生长期进行。

1.2.2MTT法检测皂荚提取物对Hela细胞生长的抑制情况 将传代的人宫颈癌Hela细胞调整浓度为5×104个/ml，每孔0.2 ml接种于96孔培养板中。随机分为对照组、皂荚提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml组，每组6复孔。对照组不加药物，皂荚提取物各组加0.2 ml药物，培养48 h，加入5 mg/ml MTT贮液20 μl，继续培养3 h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)0.2 ml，振荡10 min，用全自动酶标仪于490 nm波长处测定各孔吸光度A值，取平均值，利用公式计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(对照组A值-实验组A值)÷对照组A值×100%。

1.2.3流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 各组Hela细胞在相应培养液中培养72 h后，收集，1 000 r/min低温条件下离心5 min，弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，调整细胞浓度为1×106/ml，加RNaseA，37℃水浴30 min，加磺化丙啶(PI)染色，低温避光30 min，用流式细胞仪检测细胞DNA含量，分析各组宫颈癌Hela细胞的凋亡率。

1.2.4免疫组化法检测Bax、Bcl-2、p53蛋白表达 取对数生长期宫颈癌Hela细胞，接种于24孔培养板，1×105个/孔，培养24 h后，随机分为对照组、皂荚提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml组，每组4复孔。对照组不加药物，皂荚提取物各组加0.2 ml药物，继续培养48 h，爬片，PBS冲洗3次，加4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤2次，按免疫组化试剂盒说明书操作检测Bax、Bcl-2、p53蛋白表达情况。胞质或胞核染成黄色或棕黄色为阳性反应，反之则为阴性。

1.2.5Hela细胞端粒酶活性检测 按照端粒酶试剂盒说明书操作方法测定：将生长期宫颈癌Hela细胞分别于无药物培养液、皂荚提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml培养液中培养，72 h后收集各组细胞，加入CHARPS裂解液0.2 ml，制成悬浮细胞。冰浴中包被30 min，以15 000 r/min低温条件离心15 min，取上清得到含端粒酶的细胞提取物，置于PCR管中，加入反应液，30℃条件下反应30 min，然后进行PCR(33个循环94℃、30 s，55℃、30 s)。使用阻断稀释缓冲液2次，加反应液5 μl，37℃条件下孵育60 min，PBS冲洗，每孔加入抗二氨基庚二酸(DAP)抗体0.1 ml，包被30 min，PBS冲洗，加四甲基联苯胺(TMB)室温包被5 min，加入0.1 ml终止液，用全自动酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度A值，取平均值，计算端粒酶活性抑制率。端粒酶活性抑制率=(对照组A值-实验组A值)÷对照组A值×100%。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.1皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞增殖的影响 不同浓度的皂荚提取物对Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，组间差异有统计学意义(P<0.05)，其中1.0 mg/ml皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞生长抑制率最高，且有一定的剂量依赖性。见表1。

2.2皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞周期的影响 不同浓度的皂荚提取物对Hela细胞周期作用72 h后，与对照组比较，在G0～G1期百分比升高，S期百分比降低，提示皂荚提取物阻止Hela细胞从G0～G1期进入S期，阻止DNA的无限繁殖，诱发宫颈癌Hela细胞凋亡。见表2。

表1 皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与0.1 mg/ml组比较：2)P<0.05；与0.5 mg/ml组比较：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

表2 皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞周期的影响

2.3皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞凋亡基因的影响 与对照组相比，皂荚提取物使宫颈癌HeLa细胞中p53和Bax表达显色加深，差异有统计学意义(P<0.05)，而Bcl-2基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。随着皂荚提取物给药浓度升高，对p53和Bax的表达具有一定的增高趋势。见表3。

表3 皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞凋亡基因表达阳性率比较

2.4皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞端粒酶活性的抑制 与对照组相比，不同浓度皂荚提取物组宫颈癌Hela细胞端粒酶均显著下降(P<0.05)，表明皂荚提取物可抑制人宫颈癌Hela细胞端粒酶活性，其中高浓度组对人宫颈癌Hela细胞端粒酶活性的抑制具有最显著的效果(P<0.01)。见表4。

表4 皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞端粒酶活性的抑制

3 讨 论

宫颈癌是最常见的一种妇科生殖系统恶性肿瘤，恶性程度高、死亡率高，且治疗后易复发，致病因素复杂，可能是病毒感染、宫颈组织病变、患者免疫功能减弱及社会环境因素等综合作用的结果〔3～7〕。目前临床上对宫颈癌的治疗以化学合成药物为主，但化疗药物常伴随产生毒副作用，持续用药又容易引起耐药性。因此，寻找高效低毒天然来源中药改变宫颈癌的生物学行为已成为治疗宫颈癌药理学领域的热点。

研究发现，皂荚提取物对乳腺癌、前列腺癌和肝癌等癌细胞具有明显的抑制作用〔8〕。本实验结果显示，皂荚提取物对人宫颈癌Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，并可诱导Hela细胞的凋亡。

Bax、Bcl-2为同源二聚体，两者在细胞内的比例变化直接影响细胞的抑制或促进凋亡程度。当Bax占优势时可诱导细胞的凋亡，反之，Bcl-2占优势时却抑制细胞的凋亡〔9，10〕。而p53主要影响细胞的修复及凋亡，对细胞周期调节因子具有一定的抑制作用，当细胞受到损伤时p53会被立即激活，使细胞停顿在G1期以便DNA得到修复，或指示其进入凋亡，阻止细胞持续分裂和癌变〔11〕。从本实验结果分析可知，皂荚提取物阻止Hela细胞从G0～G1期进入S期，阻止DNA的无限繁殖，诱发宫颈癌Hela细胞凋亡。另外，随着皂荚提取物给药浓度的升高，p53和Bax的表达具有一定的升高趋势。

端粒酶是一种核糖蛋白体酶，在细胞复制过程中维持染色体端粒长度的稳定。研究显示，端粒酶活性在多数肿瘤细胞中表达，与调控细胞增殖周期密切相关〔12〕。端粒酶活化是所有恶性肿瘤发生过程的一个必经之路，癌基因的激活或抑癌基因的失活引起细胞端粒的丢失与重新组合，导致恶性肿瘤细胞无限繁殖下去〔13〕。实验结果也显示，皂荚提取物可抑制人宫颈癌Hela细胞端粒酶活性。

本实验研究提示，皂荚提取物可明显抑制人宫颈癌Hela细胞增殖，诱导Hela细胞的凋亡，抑制Hela细胞端粒酶的活性，阻止Hela细胞的无限繁殖。其作用机制可能是抑制癌细胞活化的端粒酶，阻止癌细胞复制过程中DNA的无限繁殖，同时增加抑癌基因的活性，使癌细胞凋亡。