胃癌患者的端粒酶的表达

吴成举 谢 鑫 柴纪严 陈 靖

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032

端粒酶具有逆转录酶活性，能够以自身的RNA为模板合成端粒DNA。人端粒酶结构上主要包括三部分:①端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR);②端粒相关蛋白质1(telomerase associated—protein 1，TP1/TLP1);③端粒酶催化亚单位 (human telomerase catalytic subunit，hTERT/hTRT)另外，还有热休克蛋白、p23和dyskerin。

脊椎动物hTR二级结构包括模板区、假结体区、CR4－5区、BoxH－ACA区和CR7区。Yeo等［1］研究发现模板区是端粒酶结合端粒DNA和发挥活性作用的必需结构。Feng等［2］把MKN－45细胞hTR eDNA反式亚克隆至真核表达载体，发现MKN－45细胞的端粒酶活性受到显著抑制，细胞凋亡增多。TP1并不是端粒酶发挥活性作用所必需的［3］。hTERT是包含氨基酸残基的多态链，作为端粒酶的催化亚基具有逆转录酶的共同结构。7个蛋白质域以及端粒酶催化亚基独特的T框架保守区域hTERT mRNA水平和端粒酶的活性呈正相关使hTERT基因突变，则细胞不表现端粒酶活性;将载有hTERT基因的质粒转染端粒酶阴性的成纤维细胞，可重建端粒酶活性［4］。目前认为，hTERT是人类端粒酶活性的主要调控亚单位，hTERT一旦表达就和其它亚单位一起组装成具有高活性的端粒酶全酶［5］。所以hTR和hTERT表达可以代表端粒酶的表达量。

1 材料与方法

1.1 标本是从辽宁中医药大学附属第一医院肿瘤科2006～2011年收集的，年龄 (50±7)岁，40例胃癌患者通过活检分为:乳头状腺癌12例，管状腺癌13例，低分化腺癌4例，印戒细胞癌6例，未分化癌5例;8例良性病变胃病患者通过活检分为:胃炎2例、胃溃疡4例、胃息肉2例。

1.2 检测方法

取材:胃镜检查及活检新鲜组织，每例均在胃镜下钳取病变部位组织的胃粘膜5块，3块送病检，另2块立即放人EP管中放在液氮罐中保存，取液氮活检组织置于EP管中，迅速37℃融化后将组织块减碎，加入2ml Trizon放置12h 4℃冰箱，加入氯仿放置20分钟，取上清放入EP管中，分别加入异丙醇和乙醇放置20分钟，离心4℃ 15000 r/min离心20 min弃上清，取lμl样本沉淀加入79μlDEPC水，到A260/A280微量紫外分光光度计进行测定RNA的吸光度值。测定后，进行配置同浓度同体积的样本，准备RT－PCR和PCR。

端粒酶扩增:50μl反映体系包含 ddH2O 35μl，10倍TRAP缓冲液 5μl，dNTP混合物 0.4μl，Tag DNA 聚合酶2μl，端粒酶 hTERT引物 5'－CATCCACATCGCGGCCACCACGT －3'，5'－ TGGTCTCCACGAGCCTCCGAGCG －3'5μl，内参为β－actin引物 3μl，后按以下条件扩增:94℃ 30 S、50℃ 30 s、72℃ 90 s、循环 25次。最后 72℃延伸 10 min。PCR产物在2% 琼脂糖电泳进行分析，用EB方法显色，出现梯形条带者为阳性。

2 结果

40例原发性胃癌组织中端粒酶hTERT，呈阳性表达39例，阳性率为97.5%(39/40)，8例良性胃部病变，端粒酶阳性表达者为1例，阳性率为12.5%(1/8)。胃癌的端粒酶阳性率明显高于良性胃部病变的阳性率，差异有统计学意义 (P＜0.01)(见图)。

3 讨论

胃癌是多种致癌基因、抑癌基因相互作用以及多个遗传基因失去平衡的结果，这其中端粒酶的活化则是引起细胞永生，从而导致胃癌发生的重要和关键的步骤之一。有研究表明，端粒与细胞的寿命密切相关，端粒长度被认为是细胞有丝分裂的计数器，端粒缩短很可能是正常细胞分裂与老化的分子信号。端粒酶是由RNA和蛋白质构成的一种特殊的逆转录酶，其RNA是端粒合成的内模板，端粒酶的功能即为添加端粒重复序列末端，阻止端粒随细胞分裂而逐渐缩短，而如果端粒的长度得以维持，超过复制极限面无限制下去，细胞就会成为永生化或恶性转化细胞。端粒酶的活化在在细胞癌变过程中起了关键性的作用。通过40例胃粘膜活检组织标本端粒酶表达情况进行分析，发现胃癌活检标本端粒酶阳性率为97.5% ，明显高于非胃癌组，提示大多数胃癌组织端粒酶处于活化状态，同时可见胃部病变8例病人，其中有1例是阳性，端粒酶可以作为病情进展和恶化的重要参考指标之一。

［1］Yeo M，Rha SY，Jeung HC，et al.FEBSLett，2005，579(1):127－132.

［2］Feng RH，Zhu ZG，Li JF，et al.World J Gastroenterol，2002，8(3):436－440.

［3］Liu Y，Snow BE，Hande MP，et al.Mol CellBiol，2000，20(21):8178－8184.

［4］Yudoh K，Matsuno H，Nakazawa F，et al.J Bone Miner Res，2001，16(8):1453－1464.

［5］Chang JT，Chen YL，Yang HT，et al.Eur J Biochem，2002，269(14):3442－3450.