端粒酶的研究进展

惠子健

(山西医科大学,山西 太原 030001)

20世纪 30年代 Muller发现了保持染色体稳定的端粒结构,1985年 Greider和 Blackburn在四膜虫细胞提取物中发现了端粒酶,并证实端粒酶具有维持端粒长度的功能。1989年 Morin等人在宫颈癌的Hela细胞发现活化的人端粒酶,从此对端粒酶的研究便不断深入,本文对端粒酶的研究进展综述如下。

1 端粒酶的结构

端粒酶(Telomerase)又称端粒末端转移酶。目前认为人端粒酶结构上主要包括三种成分:端粒 RNA成分((human telomerase RNA component,hTR)、端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcip tase,hTERT)和端粒酶相关蛋白(TEP/TLP1/TP1)。在体外,仅有 hTR与 hTERT两种成分就能表达出完整端粒酶的活性。

1.1 hTR

端粒酶的 RNA亚基(hTR)是合成端粒 DNA的模板,实验证明它对端粒酶的结构和催化活性都很重要[1～3]。人端粒酶RNA于 1995年被克隆成功,基因位于 3p 26.3[4],长度 445个核苷酸,为单拷贝基因,由 RNA聚合酶Ⅱ进行转录,hTR模板序列为 5'-CUAACCCUAAC-3'[2],模板区序列与人端粒DNA序列互补。以端粒 3'-末端为引物,在端粒酶反转录酶催化下,通过模板的滚动,特异合成端粒DNA,延长端粒。端粒酶RNA的序列和长度都有保守的二级结构,从 5'到 3'方向包含四个保守的双螺旋,双螺旋Ⅰ是最保守的区域,双螺旋ⅡⅢ是茎环结构,这些保守的茎环通常是蛋白质结合区域,对保持端粒酶的功能十分重要[3]。Autexier[5]用小核核酸酶处理部分纯化的人 293细胞所构成的重组体系确定 hTR最小功能区位于44 nt～203nt,其中在 170 nt～179 nt,180 nt～189nt,190nt～199 nt间的突变均可使 hTR完全失活,提示这3个核苷酸区域对hTR活性是必须的,可能与端粒酶蛋白组分结合有关。

1.2 hTERT

端粒酶催化亚单位hTERT是具有反转录酶结构的组分[6]。1997年,Nakamura等克隆了人类端粒酶蛋白TP1(telomerase associated protein1)和 TP2(telomerase associated protein2)。其中TP1能与端粒酶RNA特异性结合,命名为端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。hTERT定位于5pl5.33,为单拷贝基因,其 cDNA也已被克隆。长度约为40 kb,可读框的翻译产物 hTERT分子量为127 kD,属于逆转录酶超家族的亚群[7]。hTERT的表达与端粒酶活性呈正向相关,端粒酶活性主要由 hTERT表达水平的高低决定[8～9]。因而认为hTERT基因转录水平是调节端粒酶活性的重要限速步骤之一[10]。目前研究证明hTERT为人端粒酶的催化亚基。

1.3 端粒酶相关蛋白

人类端粒酶相关蛋白于 1997年被克隆成功[11]。研究发现,人端粒酶相关蛋白能够协同端粒酶全酶的组装,与端粒酶体内活性有关,在端粒酶的活性调节中发挥重要作用,因此,也被称为端粒酶的调节亚基。但其在体内对端粒酶活性和端粒长度保持并不是必需的。

2 端粒酶的生物学特性

在大多数人体正常组织或者细胞中,并不表达端粒酶活性,但少数有增殖潜能的细胞,如造血干细胞、生殖细胞、皮肤细胞、免疫记忆细胞等有增殖潜能的细胞有低水平端粒酶表达。端粒酶能够以自身的RNA为模版逆转录合成端粒 DNA重复序列并添加到端粒末端,以维持端粒长度,保持染色体的相对恒定[8]。端粒酶对端粒的延伸是精确调控的过程,是各个亚单位相互协调的结果。首先,端粒酶反转录酶被激活,进而催化激活端粒酶;而后,端粒酶通过结合蛋白结合在 DNA的TG引物及端粒酶 RNA模板上,使端粒引物末端位于端粒酶 RNA模板区的起始端,然后开始合成端粒 DNA,进行到模板区的末端时,延长的 DNA末端与RNA模板配对解开,但脱落的端粒仍然结合在端粒酶结合蛋白上,其末端又结合在端粒酶 RNA模板区的起始位,如此反复合成端粒,直到端粒达到一定长度后终止。

端粒酶不只是专一地合成端粒重复序列,已有一些实验证实其具有其他功能如抗细胞凋亡、DNA修复等。

在不同的细胞系中端粒酶都有抗凋亡的作用[12]。在肿瘤细胞中,抑制端粒酶的活性能诱导肿瘤的凋亡,而且凋亡的出现要远远早于端粒的明显缩短[13]。正常的成纤维细胞表达端粒酶就能使细胞对凋亡和坏死更有抵抗力[14]。提示端粒酶在细胞抗凋亡过程中有很重要的作用。

端粒酶在DNA修复或抑制DNA破坏的过程中也起重要作用。在神经细胞中,表达 hTERT能保护细胞免受 DNA破坏因素引起的凋亡[15],Shnana.GG[16]等人的实验显示,外源性hTERT转入不仅能够使一些 DNA修复基因转录活性增高,而且能够通过提高dNTP的水平来维持染色体稳定、提高DNA修复功能。

3 端粒酶活性的调节

由于端粒酶能够调节端粒长度以及抗细胞调亡、DNA修复等的特殊功能,因此基于端粒酶活性调节的研究成为焦点,分为诱导端粒酶活性与抑制端粒酶活性两个方向。

3.1 诱导端粒酶活性

组织细胞工程学中,定向诱导干细胞分化为各种组织细胞以及体外支架诱导细胞塑造人工器官研究越来越深入。因此增加端粒酶的活性,维持细胞分化和增殖能力,延长细胞的寿命抑制细胞衰老具有重要意义。目前的研究方法是将携带hTERT基因的载体转染干细胞,激活端粒酶,使被转染的干细胞端粒酶活性升高。Sarin等[17]研究发现,在小鼠上皮组织表达TERT时,可以使毛发终止期的毛囊干细胞转化为活跃期,小鼠长出了新长的毛发。Simonsen等[18]将外源性端粒酶反转录酶转染人间充质干细胞,诱导向成骨细胞分化,转染后骨髓间充质干细胞端粒酶活性增高,260个群体倍增水平后细胞还能继续分裂,核型正常不致瘤,表达成骨细胞标志,使细胞活力大大增强。Bodnar AG等[19]将编码了人类端粒酶催化亚基的载体转染到视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞中,这两种细胞在正常人细胞中端粒酶表达呈阴性,结果发现端粒酶表达呈阴性的细胞的端粒缩短、细胞衰老,而端粒酶表达呈阳性的细胞的端粒伸长,细胞分裂旺盛。这些端粒酶阳性细胞的寿命超出正常细胞的寿命 40倍,核形正常。

3.2 抑制端粒酶活性

研究发现80%以上的肿瘤组织端粒酶活化,虽然不是肿瘤发生的早期因素,但肿瘤中端粒酶的活化是肿瘤发生的一个重要步骤,而且与肿瘤的增殖、分化、凋亡、转移和周期等相关。而正常组织中(包括正常干细胞)端粒酶的表达水平较低或只是暂时性表达,且与肿瘤细胞相比端粒较长,因此基于抑制端粒酶活性的癌症治疗药物成为可能。目前的研究方向主要集中在酶直接抑制剂、端粒酶主动免疫治疗,以及干扰端粒酶反转录过程等几个方面。已有大量综述和论文报告端粒酶抑制剂的研究现状,本文不再一一介绍。

有效和特异的小分子抑制剂至今尚未能找到[20]。端粒酶作为癌症靶标仍然处于临床早期阶段。人们还未能完全了解端粒酶的作用和其在正常生物学和癌症病理生理学中的端粒动力学,近期研究人员在部分肿瘤细胞中发现了端粒延长的旁路途径,使面临的问题更加复杂化,目前临床试验中的药物可能并不能通过最终验证,无疑面临着诸多挑战与机遇。

4 问题与展望

综上所述,目前对端粒酶的了解尚不充分,现有研究在阐明端粒酶的作用机理方面虽然取得了不少进展[21～22],但在分子水平上对端粒酶的具体调控机制仍不明了,端粒酶活性变化的规律还有待揭示。因此研究仍处在起步阶段,对端粒酶活性的调节还无法做到时间和活性的精确控制。但随着研究的深入,端粒酶的秘密将逐渐被揭开。将对人类延缓衰老,治疗疾病开辟出新的途径。

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