电针对脑卒中后抑郁大鼠脑神经细胞γ-氨基丁酸、血管内皮生长因子表达的影响

赵立峰 傅润熹 严嘉宁 余 涛 陆方琴 韦登明

(宁波大学医学院病理教研室，浙江 宁波 315211)

针刺治疗脑卒中后抑郁(PSD)在临床上有确切的疗效〔1〕，但其治疗机制尚不完全清楚。普通抑郁症的发病与谷氨酸与γ-氨基丁酸(GABA)及其受体变化有关； GABA及其受体表达增多具有神经毒作用，通常认为缺血使兴奋性氨基酸增加，胞内Ca2+聚集，继而引发一系列反应，最终导致神经元死亡。脑缺血过程中伴有的血管内皮生长因子(VEGF)表达水平变化与缺血性脑血管病的发生、发展及预后密切相关。VEGF除了通过调控新生血管的形成对缺血性脑损伤后的神经细胞具有直接的营养和保护作用外，还具有其他多种直接和间接的神经保护作用〔2〕。针刺是一种安全无毒疗效显著的治疗手段，经过前期研究工作的积累，已经确定其对PSD有治疗效果〔3〕。但PSD的发病及电针治疗机制是否与脑神经细胞GABA及VEGF的表达含量变化有关尚未见报道。本实验旨在通过检测电针对PSD大鼠脑神经细胞GABA及VEGF表达含量的影响，研究电针对PSD的治疗效果和相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 Wistar大鼠40只，购于浙江大学医学院实验动物中心，合格证号0102016。均为雄性，体重280～320 g，自由饮食。大鼠适应性喂养7 d后，分为正常组，假手术组，模型组和电针组，每组10只。

1.2试剂仪器 G6805 电针仪(上海华谊仪器制造厂生产)，旷场及记录仪(上海移数动物学系统)，兔抗大鼠GABA多克隆抗体、兔抗大鼠VEGF多克隆抗体、生物素化羊抗兔 IgG、链霉亲合素-生物素(SABC)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，JD801形态学图像分析系统(江苏捷达科技发展有限公司)，BM-Ⅶ包埋机(宏业医用仪器公司)；HM-325石蜡切片机(德国LEICA公司)；CX40生物显微镜(日本olympus公司)。

1.3模型制备 以10%水合氯醛0.3 ml/100 g，腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上，颈部正中切开皮肤，暴露双侧颈总动脉(CCA)和迷走神经。将CCA用动脉夹夹闭10 min，再通20 min，再夹闭10 min。以青霉素局部消毒再缝合，放回鼠笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上，但不夹闭CCA。饲养7 d后进行行为学检测。对脑卒中模型成功大鼠予以孤养、慢性不可预见的温和性应激(CUMS)制备PSD模型〔4〕：①禁食禁水20 h；②禁水17 h；③倾斜鼠笼(45°)17 h；④持续光照17 h；⑤湿笼(100 g锯屑+200 ml水)21 h；⑥4℃强迫游泳5 min；⑦水平摇晃5 min；⑧行为限制(束缚)2 h；⑨夹尾1 min。9种刺激每日随机采取1种，共21 d，单笼饲养，再次进行行为学检测。

1.4电针治疗方法 PSD模型成功后，电针“百会”、“大椎”，“百会”位于顶骨正中，“大椎”在第7颈椎与第1胸椎间，背部正中。施以连续波，频率50 Hz，强度以大鼠安静耐受为度(约2.0 rflA)，每天电针1次，留针20 min，连续治疗15 d。

1.5检测方法

1.5.1行为学检测 采用旷场试验(open-field)法〔5〕，用小动物行为学分析系统测定5 min内大鼠穿线次数和抬壁次数，其中第1分钟不计时，大鼠适应环境，保持环境安静与黑暗。

1.5.2脑组织GABA和VEGF免疫组织化学染色观察 以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g体重)，暴露心脏，先以生理盐水100 ml经主动脉冲洗，继续灌注由4%多聚甲醛与1%戊二醛组成的磷酸缓冲液(pH7.4)200 ml，再持续滴注40 min，断头取脑。石蜡包埋切片后进行免疫组织化学染色。切片经常规脱蜡、脱水、3%H2O2灭活内源性酶、微波抗原修复，正常山羊血清封闭，分别滴加VEGF和GABA一抗，湿盒中4℃冰箱过夜。滴加相应二抗，SABC反应，二氨基联苯胺(DAB)显色。分色、脱水、透明、封片、光学显微镜下观察免疫组化染色结果。阴性对照：用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗；阳性区域为棕黄色，400倍光镜下，每张切片随机选取4个视野检测，计算平均积分光密度。

1.6统计学检测 采用SPSS13.10软件行单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。

2 结 果

2.1电针治疗对大鼠行为学表现的影响 正常组与假手术组穿线次数〔(17.10±4.90)次 vs (13.6±3.43)次〕、抬壁次数〔(14.1±3.41)次vs(12.3±3.71)次〕的差异无统计学意义(P>0.05)，但模型组的穿线次数〔(8.29±2.75)次〕、抬壁次数〔(5.71±1.80)次〕较正常组和假手术组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；电针治疗后，电针组的穿线次数〔(9.36±4.39)次〕、抬壁次数〔(7.10±5.15)次〕较模型组明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示电针对PSD大鼠的抑郁有改善作用。

2.2电针对脑组织GABA、VEGF表达的影响 模型组GABA明显升高，脑神经细胞染色呈强阳性；与模型组比较，电针组GABA表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组VEGF的表达较假手术组升高，电针组VEGF的表达与模型组比较明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1，图2，表1。

图1 GABA免疫组织化学染色图(×400)

图2 VEGF免疫组织化学染色图(×400)

表1 电针对大鼠脑组织GABA及VEGF表达的影响

3 讨 论

急性脑卒中患者预后最常见的精神心理障碍就是抑郁。据相关报道，急性脑卒中患者并发抑郁最高可达60%〔6〕。针刺作为中医治疗的一种手段，具有安全、无毒、疗效显著等优点。PSD患者更易出现认知功能损害，电针抗抑郁治疗后抑郁症状缓解，认知功能亦可好转〔7〕。针刺治疗 PSD 的效果与口服盐酸氟西汀胶囊相当，且具有起效快、副反应小、明显提高患者生存质量的优越性。然而，针刺治疗PSD的机制尚不十分清楚，限制了针灸疗效的进一步提高。百会位居巅顶，与大椎均为诸阳之会，刺之可调动一身之阳气；乔瑞瑞等〔8〕研究表明电针此两穴对慢性抑郁确有疗效。本研究提示，电针对PSD大鼠的行为表现有改善作用，提示电针百会与大椎穴位有改善PSD的效果。

碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、VEGF及表皮生长因子(EGF)等均可促进海马神经干细胞的增殖与分化〔9〕。抑郁症患者海马体积缩小，神经元的修复可以使其恢复正常。大脑海马部有较多的生长因子(如bFGF、EGF、VEGF)〔10〕，本实验结果提示电针百会与大椎穴位可促进脑神经细胞高表达VEGF，再次印证了海马VEGF对神经元的修复与再生是有重要意义的。笔者推测，电针通过促进脑神经细胞VEGF高表达，提高神经元修复能力，达到抗PSD的治疗效果。

脑卒中时，GABA(抑制性递质)与谷氨酸(兴奋性递质)对脑神经细胞有较大的毒性，PSD的发生机制与GABA表达失衡有明显关系。本实验免疫组织化学染色结果提示GABA高表达参与PSD的发病过程，电针可抑制PSD大鼠脑神经细胞GABA的表达。

综上所述，电针对PSD有一定的治疗效果，其机制可能与下调脑神经细胞GABA水平和促进对神经损伤有修复效果的VEGF高表达有关。