miR-145过表达增强非小细胞肺癌细胞的放疗敏感性

2018-10-31 03:58饶石磊
中国老年学杂志 2018年19期
关键词:存活率敏感性试剂盒

杨 峥 房 娜 饶石磊

(南阳市中心医院肿瘤放疗科,河南 南阳 473009)

非小细胞肺癌常见的治疗方法为放疗和化疗,虽然取得了一定的成效,但是仍然有40%的非小细胞肺癌患者预后极差〔1〕。miRNA是一类非编码的单链的RNA,在生命体内广泛表达。miRNA不仅参与胚胎发育、组织器官形成等生理过程,心血管系统疾病、消化系统疾病等发病过程中也具有调控作用〔2~4〕。miR-495、miR-7、miR-210等多种miRNA已经被证实参与肿瘤的发生,影响肿瘤细胞的放疗敏感性〔5,6〕。miR-145在结直肠癌、肺癌、肝癌、宫颈癌等癌症组织中表达下调,发挥抑癌基因类似作用〔7~9〕。Wnt信号通路下游靶基因(c-myc)、β-连环蛋白(β-catenin)分别是Wnt信号通路的下游靶基因和关键调控因子,而Wnt信号通路参与肿瘤细胞的生长和调控〔10〕。本研究探讨miR-145对非小细胞肺癌增殖、凋亡及放疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1细胞 非小细胞肺癌细胞株A549、Calu-3、H460、SPC-A-1及支气管黏膜上皮细胞16HBE均购自中科院上海细胞库

1.2主要仪器及试剂 兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(酶切Caspase-3)一抗、兔抗c-myc一抗、兔抗β-catenin一抗、羊抗兔二抗均购自美国Santa Cruz;胰蛋白酶、RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco;RT-PCR检测试剂盒、细胞蛋白提取试剂盒、RNA提取试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒均购自美国Promega;miR-145、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物由上海生工合成;Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Thermo;miR-145模拟物(miR-145 mimics) 、阴性对照(mimics control)购自上海吉玛制药技术有限公司;CO2培养箱购自德国宾得。

1.3细胞培养 非小细胞肺癌细胞株A549、Calu-3、H460、SPC-A-1及支气管黏膜上皮细胞16HBE用含有90% RPMI1640培养基、10%胎牛血清的细胞培养液培养。液氮中保存的细胞放在37℃,1 min内融化,用RPMI1640培养基悬浮后,800 r/min离心10 min,用5 ml的细胞培养液悬浮细胞,接种到细胞培养瓶中,在37℃,5%CO2培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞密度达到80%时,弃去细胞培养液,用0.25%的胰蛋白酶在37℃消化,观察细胞呈单个存在时,加入3 ml的细胞培养液,按照1∶2接种到细胞培养瓶中培养。

1.4RT-PCR检测细胞中miR-145表达 取培养至对数生长期的非小细胞肺癌细胞株A549、Calu-3、H460、SPC-A-1及支气管黏膜上皮细胞16HBE,按照RNA提取试剂盒提取细胞中的RNA,紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。RT-PCR检测试剂盒检测细胞中miR-145水平,内参基因为GAPDH。反应程序为:95℃预变性5 min,(94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min)×40个循环,72℃总延伸5 min。以2-△△Ct法计算miR-145水平。miR-145上游引物为5'-GGCTGGATGCAGAAGAG-3',下游引物5'-GCCTTCTTCTTGAACCCTCA-3'。GAPDH上游引物为5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3',下游引物5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

1.5细胞转染 取培养至对数生长期的非小细胞肺癌细胞,胰蛋白酶消化后,以每孔中3×106个细胞接种到6孔细胞培养板中培养,待细胞融合度为60%时,将细胞换成是不含血清的培养液孵育1 h。根据Lipofectamine 2000转染试剂将miR-145 mimics 和mimics control转染至细胞中,培养48 h后,RT-PCR检测细胞中miR-145的表达水平,同时检测不做处理的未转染细胞中miR-145的表达水平,步骤参照1.4。

1.6放射处理及细胞分组 非小细胞肺癌细胞放射处理方法为:6MV-X射线进行室温垂直照射,200 cGy/min剂量率,15 cm×15 cm照射野,100 cm源皮距SSD。非小细胞肺癌细胞分为4组,依次为对照组、miR-145组、放疗组、联合组,其中对照组细胞为未转染的细胞不经放射处理,miR-145组和联合组为转染miR-145 mimics后48 h的非小细胞肺癌细胞,放疗组为未转染的细胞。联合组在细胞转染后48 h进行放射处理,与此同时对放疗组细胞也进行同样剂量的放射处理。

1.7噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 对照组、miR-145组、放疗组、联合组细胞接种到96孔细胞培养板中,每组设置6个复孔,每孔中加入1000个细胞,观察细胞贴壁后,按照1.6中方法处理,照射剂量为8 Gy,在37℃、5%CO2培养箱培养48 h。每孔中加入MTT溶液10 μl(5 mg/ml),放在37℃培养4 h,弃去细胞培养液,加入二甲基亚砜溶液150 μl,观察结晶物溶解后,酶标仪测定490 nm的光密度值(OD值),计算细胞存活率,同时设置空白组,空白组不加细胞。细胞存活率=100%×(实验组OD值-空白组OD值)÷(对照组OD值-空白组OD值)。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡 对照组、miR-145组、放疗组、联合组细胞经过8 Gy照射处理后,培养48h,胰蛋白酶消化后,收集1×106个细胞,1 500 r/min离心10 min。用冰预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次,用200 μl的结合缓冲液悬浮细胞后,分别依次加入碘化丙啶(PI)和膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)各5 μl,混合,避光条件下孵育20 min,加400 μl缓冲液,流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.9细胞克隆实验 对照组、miR-145组细胞以1×106个/孔接种到6孔培养板中过夜培养。在0、2、4、6、8 Gy剂量照射处理细胞,进行照射,培养12 d,用冷甲醇固定后,姬姆萨染色30 min。在显微镜下观察大于50个细胞的集落数目,计算集落形成率(PE):PE=集落形成数/种植细胞数×100%。拟合细胞存活曲线,计算放射增敏比。

1.10Western印迹检测细胞中酶切Caspase-3、c-myc、β-catenin表达 对照组、miR-145组、放疗组、联合组细胞经过8 Gy照射处理后,培养48 h,提取细胞总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒检测提取的蛋白浓度。蛋白样品与2倍上样缓冲液按照2∶1比例充分混合后,放在100℃条件下煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝胶上样孔中按照50 μl/孔加入变性蛋白样品,80 V电压观察溴酚蓝进入浓缩胶和分离胶的交界处时,120 V电压电泳结束。转膜:4℃,100 V电压转膜90 min。封闭:5%脱脂奶粉,37℃,90 min。一抗孵育:800倍稀释,4℃,过夜。二抗孵育:1 000倍稀释,37℃,90 min。滴加显色液,显影,定影后,曝光,以GAPDH为内参,用目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.11统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1细胞中miR-145 mRNA表达 16HBE、A549、H460、Calu-3、SPC-A-1细胞中miR-145 mRNA水平依次为:1.00±0.04、0.35±0.03、0.61±0.05、0.23±0.02、0.46±0.06。miR-145 mRNA水平在5组中比较差异有统计学意义(F=147.750,P=0.000),支气管黏膜上皮细胞16HBE中miR-145 mRNA表达水平明显高于非小细胞肺癌细胞株A549、Calu-3、H460、SPC-A-1,差异有统计学意义(tA549=18.764,tCalu-3=22.228,tH460=11.258,tSPC-A-1=15.589,均P<0.05),而在Calu-3细胞中表达水平最低(tA549=3.464,tH460=10.970,tSPC-A-1=6.640,均P<0.05),后续选用Calu-3细胞继续研究。

2.2细胞转染效果 未转染、mimics control、miR-145 mimics细胞中miR-145 mRNA水平依次为:1.00±0.08、1.01±0.19、2.04±0.20,各组细胞中差异有统计学意义(F=38.956,P=0.000)。Calu-3细胞转染miR-145 mimics后细胞中miR-145 mRNA表达水平升高(t=7.681,P<0.05),而转染mimics control后细胞中miR-145表达没有明显变化。

2.3细胞增殖凋亡检测结果 对照组、miR-145组、放疗组、联合组细胞存活率依次为:100.00%、(61.22±4.09)%、(62.47±9.63)%、(36.69±6.48)%,凋亡率依次为:(10.75±2.89)%、(37.94±8.06)%、(40.37±4.84)%、(56.24±3.57)%。各组细胞存活率和凋亡率整体比较差异有统计学意义(F存活率=54.065;P存活率=0.000,F凋亡率=39.079,P凋亡率=0.000),miR-145组、放疗组、联合组细胞存活率均明显低于对照组(tmiR-145组=7.719,t放疗组=7.470,t联合组=12.601,均P<0.05),并且联合组细胞存活率较放疗组明显降低(t=5.131,P<0.05)。miR-145组、放疗组、联合组细胞凋亡率较对照组明显升高(tmiR-145组=6.365,t放疗组=6.934,t联合组=10.649,P<0.05),并且联合组细胞凋亡率较放疗组明显升高(t=3.715,P<0.05)。这说明,miR-145能够加强放疗抑制Calu-3细胞增殖、促进Calu-3细胞凋亡的作用。

2.4放疗敏感性 细胞存活曲线见表1及图1,miR-145组细胞存活分数降低,并且能够增加细胞放疗敏感性,增敏比为1.363。

图1 细胞存活曲线

表1 单击多靶模型参数值

2.5细胞中酶切Caspase-3、c-myc、β-catenin表达水平 结果见图2和表2,miR-145组、放疗组、联合组细胞中酶切Caspase-3水平明显高于对照组(tmiR-145组=5.907,t放疗组=3.846,t联合组=11.950,均P<0.05),并且联合组细胞中酶切Caspase-3水平较放疗组明显升高(t=8.104,P<0.05)。而miR-145组、放疗组、联合组细胞中c-myc、β-catenin表达较对照组明显降低,并且联合组细胞中c-myc、β-catenin表达较放疗组明显降低(均P<0.05)。这说明,miR-145能够协同放疗诱导的酶切Caspase-3表达和放疗抑制的c-myc、β-catenin表达。

图2 Western印迹检测酶切Caspase-3、c-myc、β-catenin表达

表2 各组细胞中酶切Caspase-3、c-myc、β-catenin相对表达水平

与对照组比较:1)P<0.05;与放疗组比较:2)P<0.05

3 讨 论

据统计,肺癌在5年的生存率不超过20%,而在肺癌中有超过80%的患者属于非小细胞肺癌〔11〕。由于非小细胞肺癌具有发展快、易转移、早期临床症状不明显等特点,大多数患者在确诊时已经是癌症晚期。目前治疗非小细胞肺癌的主要手段为放疗及化疗,随着治疗技术的不断发展,基因或者miRNA靶向治疗提高非小细胞肺癌放疗敏感性已经是目前研究的趋势。miR-143在结直肠癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌等癌症中表达调,能够抑制癌细胞的生长,增加癌细胞的放疗敏感性和对抗肿瘤药物的敏感性〔12~15〕。Eades等〔16〕研究表明,miR-145在乳腺良性病变中的表达水平约为乳腺癌的2倍。Kim等〔17〕通过体外细胞实验发现,miR-145能够抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖、侵袭过程,而且能够增加SKOV3细胞对紫杉醇的敏感性。Chen等〔18〕通过RT-PCR检测了收集的31例非小细胞肺癌组织中的miR-145发现,miR-145在非小细胞肺癌组织中表达下调,并且能够抑制SPC-A1细胞侵袭能力。这些研究结果均说明,miR-145参与肿瘤细胞的生长过程。本研究结果发现,miR-145在正常的支气管黏膜上皮细胞16HBE中的表达水平高于非小细胞肺癌细胞株A549、Calu-3、H460、SPC-A-1,并且通过体外细胞实验发现miR-145能够抑制非小细胞肺癌细胞的生长,促进非小细胞肺癌细胞凋亡。本研究结果同样说明,miR-145具有抗肿瘤作用。

放射治疗是目前常用的治疗癌症的方法,是除手术治疗之外较为常用的辅助疗法。叶宸〔19〕研究发现,miR-145不仅具有促进宫颈癌细胞凋亡,抑制宫颈癌细胞生长的作用,而且能够增加宫颈癌细胞放疗敏感性。本研究结果发现,miR-145过表达增加放射导致的非小细胞肺癌细胞的凋亡增加和非小细胞肺癌细胞的增殖抑制,并且能提高非小细胞肺癌放疗敏感性。本研究结果表明,miR-145具有提高非小细胞肺癌放疗敏感性的作用。

细胞生长、凋亡等过程受到多种基因的调控作用。Wnt信号通路参与细胞内信号转导过程,调控细胞的生长和凋亡,参与肿瘤的发生〔20〕。有研究表明,在非小细胞肺癌中Wnt信号通路的关键蛋白β-catenin表达上调,下游靶基因c-myc水平升高,Wnt信号通路异常激活〔21〕。Li等〔22〕研究表明,干细胞因子SOX2能够通过作用于Wnt信号通路调控肺癌的发生。酶切Caspase-3是细胞凋亡发生中的凋亡执行因子,是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志,检测其表达水平可以间接反应细胞凋亡的发生情况〔23〕。本研究结果发现,miR-145过表达能够促进非小细胞肺癌细胞中酶切Caspase-3的表达,抑制c-myc、β-catenin的表达。这提示,miR-145可能通过作用于酶切Caspase-3和Wnt信号通路调控非小细胞肺癌的生长、凋亡和放疗敏感性。

总之,miR-145增加放疗诱导的非小细胞肺癌细胞的凋亡,增强放疗对非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用,增加非小细胞肺癌细胞的放疗敏感性,Wnt信号通路可能是其作用机制之一,对于其具体的作用机制还仍需要进一步探讨。

猜你喜欢
存活率敏感性试剂盒
6种非洲猪瘟荧光PCR试剂盒对比试验
农药残留快速检测试剂盒的制备方法及其应用研究
园林绿化施工中如何提高植树存活率
经前烦躁障碍症发病与四氢孕酮敏感性中西医研究进展
损耗率高达30%,保命就是保收益!这条70万吨的鱼要如何破存活率困局?
水产小白养蛙2年,10亩塘预计年产3.5万斤,亩纯利15000元!存活率90%,他是怎样做到的?
试剂盒法制备细胞块的效果及其技术要点
丹参叶片在快速生长期对短期UV-B辐射的敏感性
4种试剂盒提取病理组织切片中裂头蚴DNA效果的比较
受害者敏感性与报复、宽恕的关系:沉思的中介作用