当归多糖对肝细胞Hepcidin表达的影响

任 峰 李 健 贺国洋 贾昭华 千新来

(新乡医学院护理学院，河南 新乡 453003)

铁是人体维持正常生理活动必不可少的微量元素，参与氧转运、电子传递、DNA合成及许多酶促反应等生理过程。越来越多的证据显示，机体铁过载通过影响DNA合成与复制、基因转录后调控、细胞铁摄取与外排等促进肿瘤的发生和发展〔1,2〕。膜铁转运蛋白(FPN)是细胞唯一的铁输出蛋白。Hepcidin是维持机体铁稳态关键调节因子〔3,4〕，能够结合、降解细胞膜上FPN，减少机体铁的吸收和巨噬细胞铁的释放，增加循环可利用铁〔5,6〕。研究表明，机体铁病理性积累可能与肿瘤的发生、演进密切相关，去铁治疗已经成为一种新的肿瘤治疗方案〔7〕。当归多糖(ASP)是传统的补血、活血中药。近年研究表明，ASP具有增强机体免疫力和抗肿瘤作用〔8～11〕。本研究探讨ASP对Hepcidin的调节作用，以期为ASP抗肿瘤药物开发和临床治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1细胞 人正常肝细胞L-02和人肝癌细胞HepG2购自武汉大学细胞保藏中心，常规培养。

1.2试剂 当归多糖(纯度>98%，陕西慈缘生物技术有限公司，批号CY110320)，无支原体胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)， RPMI1640培养基，(美国Invitrogen公司)，青链霉素(美国Hyclone公司)，RT-PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs(日本TaKaRa公司)，anti-Hepcidin，anti-β-actin抗体(英国abcam公司)。

1.3细胞总RNA提取、定量和RT-PCR 细胞处理：细胞接种于6孔板后培养12 h，观察生长状态。ASP最佳诱导浓度的确定，实验分4组，分别用0、100、200、400 mg/L的ASP诱导HepG2和L-02细胞48 h，以0 mg/L的ASP为对照组。APS最佳诱导时间的确定，实验分5组，用400 mg/L的ASP诱导HepG2和L-02细胞0、24、48、72 h和96 h，以ASP诱导0 h为对照组。按Trizol试剂说明书，提取细胞总RNA并定量。按照RT-PCR试剂盒进行逆转录反应，以合成的cDNA为模板采用RT-PCR方法检测Hepcidin mRNA表达。Hepcidin引物序列：正义链5′-cctgaccagtggctctgttt-3′，反义链5′-cacatcccacactttgatcg-3′，扩增片段长度，183 bp；GAPDH引物序列；正义链5′-aatcccatcaccatcttcca-3′，反义链5′-cctgcttcaccaccttcttg-3′，扩增片段长度580 bp。PCR反应参数：94℃预变性2 min,94℃ 1 min,51℃ 45 s，72℃ 1 min， 35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色。以GAPDH为内参照。Bandleader 3.0图像软件分析结果。

1.4Hepcidin蛋白检测 细胞处理：400 mg/L 的ASP诱导HepG2和L-02细胞96 h，以ASP未处理组为对照组。常规胰蛋白酶消化法收集对数生长期ASP处理后HepG2和L-02细胞总蛋白提取、定量及变性见参考文献〔11〕，提取总蛋白经十二烷基硫酸钠(SDS)变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后4°C封闭过夜,Ⅰ抗，Ⅱ抗孵育，检测Hepcidin蛋白表达。Hepcidin多克隆抗体(兔抗小鼠，稀释1∶100)、β-actin多克隆抗体(兔抗小鼠，稀释1∶1 000)和辣根酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗(稀释1∶5 000)。用Quantity one version 4.1.1软件对Western印迹条带进行采集和分析。

1.5统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单向方差分析。

2 结 果

2.1ASP调控HepG2和L-02细胞Hepcidin mRNA表达 不同浓度ASP(0，100，200，400 mg/L)处理HepG2和L-02细胞48 h，RT-PCR方法检测Hepcidin mRNA。结果显示，ASP(200 mg/L，400 mg/L)可显著下调HepG2和L-02细胞Hepcidin mRNA，且具有一定的剂量依赖性(P<0.01)，见图1，表1。后续实验选用400 mg/L ASP进行研究。400 mg/L的ASP处理HepG2和L-02细胞，RT-PCR方法检测不同时间点(24 h、48 h、72 h和96 h)Hepcidin的表达(图2，表2)，结果显示；Hepcidin mRNA均显著下调，且呈现时间依赖性(P<0.01)。后续实验中对HepG2和L-02细胞，ASP诱导浓度和时间采用：400 mg/L，96 h。

M：DNA marker,1～4：0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L图1 不同浓度ASP处理细胞48 h后Hepcidin mRNA表达RT-PCR扩增结果

表1 Hepcidin mRNA 水平表达变化RT-PCR检测结果

M：DNA marker,1～5：0 h、24 h、48 h、72 h和96 h图2 400 mg/L的ASP处理细胞不同时间点Hepcidin mRNA表达RT-PCR扩增结果

表2 Hepcidin mRNA 水平表达变化RT-PCR检测结果

2.2ASP对HepG2和L-02细胞Hepcidin表达的影响 用400 mg/L的ASP诱导HepG2和L-02细胞96 h，Western印迹方法检测Hepcidin的表达(图3，表3)，结果显示：ASP可明显下调HepG2和L-02细胞Hepcidin表达(P<0.01)。与对照组相比，抑制率分别为62%和74%。

1：HepG2细胞；2：ASP+HepG2细胞 3：L-02细胞； 4：ASP+L-02细胞图3 ASP对HepG2细胞和L-02细胞Hepcidin表达的影响

表3 Hepcidin蛋白水平表达变化检测结果

3 讨 论

当归为常用中药材，具有补血、调经、抗菌、消炎、镇痛、提高机体免疫力、预防和治疗糖尿病等作用。ASP为当归主要有效成分之一，现代药理研究证明ASP具有抗肿瘤作用〔8～10〕。铁过载与肿瘤的发生发展密切相关〔12～15〕。研究表明，一是肿瘤细胞快速增殖需要大量的铁，二是机体铁过载导致细胞基因突变、氧化应激损伤、癌基因激活等，增强肿瘤细胞的增殖、迁移能力，促进肿瘤血管生成〔16〕。

Hepcidin是维持机体铁稳态的小分子多肽，其作用靶点FPN是哺乳动物细胞膜上唯一的铁运出蛋白。Hepcidin能够诱导FPN泛素使其降解，发挥调控肠道铁的吸收和储铁细胞释放铁的作用，从而影响机体循环铁水平〔9，10〕。研究发现，正常人和肿瘤患者机体血清均有FPN和Hepcidin表达，但肿瘤患者Hepcidin表达显著增加且FPN表达显著减少〔17,18〕，提示Hepcidin表达增加可降解FPN，导致机体铁沉积，增加肿瘤细胞生物可利用铁〔19〕。

本研究表明，200和400 mg/L的ASP显著下调人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02 Hepcidin基因水平，且呈剂量、时间相关；Western印迹证实ASP能够在蛋白水平下调HepG2和L-02细胞Hepcidin表达。这与已报道的小分子质量ASP显著抑制大鼠正常肝细胞Hepcidin表达结果一致〔20〕。

机体铁超载是肿瘤发生的危险因素，目前尚未见通过药物治疗下调Hepcidin表达，降低机体铁负荷，抑制肿瘤恶性表型的研究报道。本文证实ASP能够在细胞水平抑制机体铁代谢关键调控因子Hepcidin的表达，但能否在体内通过下调Hepcidin的表达，降低肿瘤患者机体铁负荷还有待进一步研究。