VEGF基因沉默脂肪间充质干细胞对人MKN45胃癌细胞生长的影响

安 琳 苏慎勇 张 祎

(河北大学附属医院肿瘤内科，河北 保定 071000)

肿瘤细胞可以无限增殖至今仍是不能被人类所克服的疾病〔1～3〕。肿瘤无限增殖需要很多的条件，最为关键的一点即需要大量的血供，那么，肿瘤中的血管在肿瘤增殖转移中起着极为重要的意义，这一点也成为我们攻克肿瘤的一个着手点，如果可以减少肿瘤中血管的数量，就可以很大程度上抑制肿瘤的生长。肿瘤细胞要自我增殖，其自身可以通过多种机制使得其周围环境有益于其生长，其中当然包括最为重要的诱导的血管生成，这一过程是一个由多因素参与极为复杂的过程，而血管内皮生长因子(VEGF)则是众多因素中较为重要的一个，在血管生成中发挥着非常重要的作用〔4～7〕。研究发现VEGF是目前发现的影响血管生成作用最强诱导因子，大量实验已经证实其可以通过促进肿瘤血管的生成而促进肿瘤细胞的生长、增殖及转移〔8～11〕。它可以通过促进血管内皮细胞(EC)生长，促进肿瘤血管的生成，从而为肿瘤生长创造了有利的条件，促进肿瘤细胞的增殖及转移〔12〕。相关研究发现在一定条件下肿瘤细胞可以自己分泌大量VEGF，促进肿瘤血管形成，为自己生长，转移创造条件，血液中VEGF大部分是由于肿瘤细胞自己分泌的，故我们可以通过测定肿瘤患者血液中VEGF含量，依此来判断肿瘤生长的营养状况及肿瘤的生长情况，为寻找更有效的治疗方案提供一定的依据。 因此，有望通过抑制VEGF基因的表达，破坏肿瘤生长的有利环境，从而抑制肿瘤细胞的增殖、转移〔13,14〕。脂肪间充质干细胞(ADSCs)是干细胞的一种，因此具有与干细胞相似的特性，相关研究将其用于各种疾病的治疗，但是使ADSCs内VEGF基因沉默后观察其对肿瘤的影响研究尚少，本实验通过将ADSCs中的VEGF基因沉默后观察其对人MKN45胃癌细胞系体内生长的影响。

1 材料与方法

1.1设计、时间及地点 随机对照动物实验于2014年1月至2015年12月在河北医科大学动物实验中心完成。

1.2实验分组 根据GenBank中的VEGF基因序列及siRNA的设计原则，合成VEGF基因siRNA靶序列(5'-GATCCCCTCATCACGAAGTGGTGAAGttcaagagaCT-TCACCACTTCGTGATGATTTTTGGAAA-3')和一条阴性对照序列(即无关序列:5'-GATCCCCGTGAGATCGTAGTGCGTG-Attcaagaga-TCACGCACTACGATCTCACT-TTTTGGAAA-3')及其互补的反义链。采用Blaster软件进行比对，并因此确定siRNA对靶基因的特异性。将分别与靶序列及阴性对照序列互补的两条链经退火反应后形成双链DNA，依此作为模板链。用相应限制性内切酶将pSUPER.retro.neo载体双酶切形成线性化载体，将酶切反应产物进行电泳，然后将线性载体进行回收。然后用相应连接酶将线性载体进行连接，将模板链进行重组，形成重组载体，靶序列和阴性对照序列的重组载体分别命名为pSUPER-siRNA-VEGF载体和pSUPER-siRNA-N载体。也因此将其分为VEGF siRNA组，阴性对照组、空白对照组〔15〕。

1.3材料及来源 RNA干扰试剂盒(美国Ambion公司)、人VEGF定量酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、 Lipofectamine2000(Invitrogen生命技术公司)、RT-PCR所需引物及试剂 (Takara公司，日本)、Trizol试剂盒(杭州水然科技有限公司)、生物素标记的鼠抗人CD 34单克隆抗体(上海科顺生物科技有限 公司)、显微镜(德国Leica公司)、紫外分光光度计购于上海奥析原、细胞培养箱购买自Heraeus Sepatech 公司、血糖仪从美国Johnson & Johnson公司提供、DMEM培养基(Gibco公司)、细胞培养瓶和培养皿购于上海百研生物科技有限公司，二氧化碳培养箱购于上海人和科技有限公司。

1.4方法

1.4.1基因siRNA沉默 根据GenBank中VEGF基因序列及siRNA的设计原则，从siRNA中选取仅于VEGF具有特异性的相关的序列，而与其他序列却一点都不能匹配的序列，siRNA1：5'-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3',siRNA2:5'-GGCCAGCACATAGGAGAGA-3'，阴性对照序列：5'-GAUAGCAAUCACGAAGCGUATT-3'〔16〕。

1.4.2基因Lipofectamine2000介导转染 根据转染反应相关说明书的书写要求进行操作，所有操作开始前，首先取少量处于生长对数期的MKN45胃癌细胞，将其置于6孔板中进行培养,培养时选用的培养基不含抗生素，经过24 h的培养，细胞生长融合已达到80%～90%，然后向其中加入含有siRNA的转染试剂，加入后使其与细胞在一起孵育5 h，5 h后进行更换培养液，即倒出就得培养液同时加入新的继续进行孵育。分别在培养的24 h，48 h，72 h和96 h后收集少量转染细胞，接种裸鼠皮下，观察胃癌细胞的生长情况及用于以下实验,实验重复2次〔17〕。

1.4.3RT-PCR检测VEGF的表达 采用RT-PCR的方法检测siRNA 转染后各组细胞中 VEGF的表达情况，具体操作步骤如下：首先用Trizol试剂盒将各组细胞中总的 RNA提取出来，并从中提取少许进行逆转录反应，然后分别与转染后的24 h、48 h、72 h检测各组细胞VEGF的表达情况。β-actin 作内对照。PCR 反应体系为 50 μl。VEGF 基因 PCR 引物:扩增产物为 541 bp，正向 5'-GCCAACCTCAACTCAAGGAC-3'，反向 5'-AAGGAGCTGGATGAAGAGAC-3';β-actin 基因PCR 引 物:扩 增 产 物 为 291 bp，正 向 5'-ACCACAGCT-GAGAGGGAAATCG3'，反 向 5'-AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3'。针对抑制效果较好的序列，随机设计两对引物序列，作为siRNA的阴性对照siRNA/C1、siRNA/C2。扩增后取少许PCR产物进行电泳，并通过紫外照相进行扫描分析，用Alpha E-ase FCTM软件分析，siRNA处理24 h、48 h、72 h，VEGF的表达水平变化，实验重复3次〔18〕。

1.4.4通过CD34免疫组织化学法染色检测胃癌组织血管生成情况 将各组裸鼠处死后，取含有MKN45胃癌细胞的组织进行消化，将消化后的细胞制成细胞悬液，取少许细胞悬液滴在事先准备好的含有载玻片的6孔板上，滴加细胞悬液后置入培养箱培养，培养时间延长，待细胞融合数达80%时，进行冲洗→固定→冲洗→封闭→加入抗体→冲洗→染色，经过以上步骤后置于显微镜下，调整显微镜至低倍镜下全面观察切片，找到血管分布最密的区域，切片不动，调整显微镜至高倍镜下观察并数出同一视野下的血管数目，同样的方法分别选取5个视野进行计数，获得5个视野内血管数的平均值，依此值作为平均血管密度(MVD)值〔19〕。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0 软件进行χ2及t检验。

2 结 果

2.1RT-PCR检测VEGF的表达 与阴性对照组(0.69±0.04)和空白对照组(0.66±0.03)比较，VEGF siRNA组VEGF表达显著降低(0.33±0.02，P<0.05)，见图1。

2.2基因转染后胃癌细胞生长情况 阴性对照组和空白对照组的ADSCs在裸鼠体内可显著促进MKN45胃癌细胞的生长，两组的肿瘤重量分别为(1.84±0.12)g，(1.83±0.15)g，明显高于VEGF siRNA组的肿瘤重量〔(1.11±0.14)g，P<0.05〕，而VEGF siRNA组ADSCs在裸鼠体内对MKN45胃癌细胞的生长无促进作用，与单纯MKN45组肿瘤重量〔(1.12±0.15)g〕差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组MVD比较 阴性对照组和空白对照组MVD分别为(10.9±0.64)个/视野，(10.7±0.50)个/视野，均明显高于VEGFsiRNA组，〔(5.3±0.36)个/视野，P<0.05〕，单纯MKN45组为(5.1±0.52)个/视野，与VEGF siRNA组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 RT-PCR检测各组VEGF mRNA表达

图2 各组CD34免疫组化表达(DAB，×200)

3 讨 论

肿瘤虽有无限增殖及远处转移的特性，但是如果没有支持其无限增殖及远处转移的条件，其同样不可能实现以上过程。其中对其增殖及转移最为重要的条件即为营养支持。而肿瘤中形成血管是为其自身提供营养支持的最重要的过程。研究发现这个过程是一个由许多生长因子调控的非常复杂的过程，而VEGF是这一过程中最为重要的诱导因子，是具有相似作用的一类因子中作用最强的〔20～22〕。

干细胞可以在特定条件下分化成为多种不同的组织器官而被广泛应用于各种疾病的治疗中〔23，24〕。与骨髓干细胞类似，ADSCs由脂肪组织提取而来，因此来源较其他干细胞更广泛。以往人们认为脂肪是人体肥胖之源，瘦身后抽出的脂肪组织都当成废弃物丢弃，现经由医学专家研究证实，同骨髓中存在造血干细胞一样，脂肪组织中同样含有大量的间质干细胞，这种间质干细胞也具有体外增生及多重分化的潜力。

VEGF是一种二聚体蛋白，其分子量为34～ 50 kD，其主要作用机制有①通过增加微血管的通透性，使得血管中的分子透过血管壁到达血管外，也是肿瘤细胞可以透过血管壁进入血液，即造成肿瘤的血液转移；②通过作用于EC上相应受体而促进EC的增殖。通过以上作用机制为肿瘤细胞的生长及转移提供了有利的条件〔25～28〕。大量研究证实在各种肿瘤患者血液中VEGF含量均明显升高〔29～33〕。肿瘤的转移需要经过一系列复杂的过程，在其中生长出血管是其转移过程必须包括的一步。相关研究表明MVD与肿瘤生物学特性有密切的关系〔34～37〕，因肿瘤血管可以为肿瘤提供重要的营养支持，在尚未形成血管的时候，肿瘤是很少甚至不发生转移的，随着发病时间的延长，慢慢地在其中生成血管且数量逐渐增多，这使得肿瘤细胞获得充足营养进行增殖，并且进入血管的机会也大为增加，这与其周围环境有利于其进入血管有关。众多研究发现，随着MVD的增加肿瘤侵袭转移等恶性潜能也明显增加〔38～40〕。

本研究结果显示ADSCs 内VEGF基因沉默后VEGF明显降低，与MKN45胃癌细胞混合后接种对胃癌组织血管形成和胃癌生长无影响。