补阳还五汤对缺氧预适应心脏成纤维细胞促心脏干细胞迁移的影响

金鑫瑶 朱 征 陈 娜 李 娜 曾文赟 王一婧 姜希娟

(天津中医药大学，天津 300193)

心肌梗死为临床常见急危重症，其发病率有上升趋势。心肌梗死最主要的病理改变是冠脉狭窄堵塞导致心肌细胞的缺血缺氧甚至坏死。心脏成纤维细胞(CFs)为心肌最主要的细胞成分，其旁分泌作用对于维持心肌细胞微环境有重要作用。Messina等〔1，2〕研究表明心脏干细胞能自我更新、多能分化，其一旦被激活，可迅速迁移、分化形成心肌和冠脉血管。心肌局部缺血缺氧可激活诱导心脏干细胞迁移〔3〕，而CFs在心肌缺血缺氧时其旁分泌作用可能对于心脏干细胞的迁移有重要影响。补阳还五汤作为临床常用的治疗心肌梗死后气虚血瘀证的药物，其具体的作用机制不详〔4〕。本实验研究补阳还五汤对缺氧预适应心脏成纤维细胞促心脏干细胞迁移的影响并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 新生1～2 d的昆明小鼠，雌雄不限。

1.2实验药物及试剂 补阳还五汤饮片购于天津中医药大学第一附属医院国药堂；8 μm孔径Transwell小室购自美国Corning公司(3422)；DMEM/F12培养基干粉袋购自美国Gibco公司(12400-024)；兔抗小鼠Vimentin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司(PB0378)；结晶紫购自美国Sigma公司(C3886)；FastLine细胞到cDNA快速制备试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化科技有限公司(KR105、205-02)；SCF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、SDF-1 ELISA试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司(SEA120Mu、SEA122Mu)。

1.3细胞培养及鉴定 ①CFS的培养及鉴定：新生的昆明小鼠按文献〔5〕的方法获得原代及传代培养的CFS。实验时将培养的细胞同步化。取传代2次后的CFS爬片至盖玻片上，经Vimentin免疫荧光染色鉴定，阳性染色细胞数达95%以上，符合后续实验要求。②心脏干细胞的培养及鉴定：小鼠心脏干细胞，由美国西北大学医学院芬伯格心血管研究所覃刚健教授惠赠，培养方法同前。经c-kit免疫荧光染色鉴定，阳性染色细胞数达95%以上，符合实验要求。

1.4CFS缺氧预适应模型的建立 取生长状态良好的第2代细胞，消化后离心，调整细胞密度为4.8×105/ml，以每孔2.5 ml接种至6孔板中。将细胞培养24 h后置于三气培养箱(5%CO2+94%N2+1%O2)中缺氧预适应24 h，复制缺氧模型。

1.5补阳还五汤含药血清的制备及实验分组 两组SD大鼠分别用生理盐水、补阳还五汤(原方剂量根据徐叔云教授主编的《药理实验方法学》等效换算法计算出大鼠生药量为12.87 g/kg)持续灌胃1 w。制备出空白胎牛血清(FBS)及补阳还五汤含药血清，经高效液相色谱分析该含药血清符合实验要求。将实验分为对照组(缺氧0 h+10%空白FBS)、模型组(缺氧24 h+10%空白FBS)和补阳还五汤组(缺氧24 h+10%含补阳还五汤的FBS)。37℃培养箱培养24 h后，收集各组成纤维细胞培养液上清及CFS，置于-80℃保存以备后续实验使用。

1.6心脏干细胞迁移实验 无菌条件下打开内置8 μm孔径Transwell小室的24孔板，每个小室内加入200 μl含2%FBS的DMEM/F12培养基，置于37℃培养箱内湿化2 h。每个小室内加入100 μl 细胞密度为1×105的心脏干细胞悬液，而24孔板内分别加入600 μl各组CFS培养液上清，于37℃培养12 h。取出各组Transwell小室，用棉球小心擦去小室膜上侧细胞，保留膜下侧细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡小室洗涤细胞2次。4%多聚甲醛固定细胞15 min，经PBS洗涤2次。再用0.1%结晶紫染色15 min，PBS洗涤3次，风干后200倍镜下选取5个视野计算心脏干细胞迁移数，重复实验3次取其平均值。

1.7RT-PCR法检测各组CFS中SCF、SDF-1 mRNA的表达 按FastLine细胞到cDNA快速制备试剂盒说明操作，快速制备出经过反转录的cDNA，经微量紫外分光光度计检测cDNA浓度。以cDNA为模板，按SYBR Green试剂盒说明操作进行PCR扩增。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，具体引物序列见表1。配成25 μl反应体系：cDNA 1 μl，2×SuperReal premix plus 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)0.75 μl，下游引物(10 μmol/L)0.75 μl，50×Rox reference dye 0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。设定PCR反应条件：95℃ 15 min，预变性及热启动→95℃ 10 s，变性→60℃ 30 s，退火→40个循环→72℃充分延伸。实验数据根据目的基因和内参基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算出各样品中目的基因的相对表达量。每组6个样本，每样重复3孔，实验独立重复3次。

表1 具体引物序列

1.8ELISA检测各组CFS培养液上清中SCF、SDF-1蛋白旁分泌量 按照说明书严格进行操作。设空白孔、标准孔、样品孔，除空白孔不加外，其余孔依次加入标准品及待测样品50 μl，立即加入检测溶液A工作液50 μl，贴覆膜，37℃恒温箱孵育1 h；弃去液体，洗涤液充分洗涤，加入检测溶液B工作液100 μl，贴覆膜，37℃温育30 min；弃液洗涤，再加底物溶液90 μl，贴上覆膜，37℃避光显色20 min；出现梯度蓝色时，加终止溶液50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450 nm波长下测量各孔光密度(OD)，每组6个复孔，重复实验3次，取其平均值。

1.9统计学处理 使用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组CFS培养液对心脏干细胞迁移的影响 由图1发现：与对照组(29.83±5.98)相比，模型组心脏干细胞迁移数目明显增多(41.00±4.73，P<0.05)，提示缺氧24 h可促进心脏干细胞迁移；而补阳还五汤组进一步增加心脏干细胞的迁移数(50.50±8.02)，较之模型组差异有统计学意义(P<0.05)，说明补阳还五汤具有促心脏干细胞迁移的作用。

2.2各组CFS中SCF、SDF-1 mRNA表达 模型组SCF、SDF-1 mRNA表达水平下调，与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05)；而补阳还五汤组上调SCF、SDF-1 mRNA的表达，与模型组比较差异有统计学意义(均P<0.05)，提示补阳还五汤可能通过上调缺氧预适应的CFS中SCF、SDF-1 mRNA表达水平进而促进心脏干细胞迁移，见表2。

图1 结晶紫染色观察心脏干细胞迁移情况(×100)

表2 各组培养液上清中SCF、SDF-1 mRNA表达情况

与对照组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05，下表同

2.3各组CFS培养液中SCF、SDF-1的蛋白分泌情况 由表3得出，模型组SCF、SDF-1蛋白分泌水平较之对照组下调，SCF差异有统计学意义(P<0.05)，SDF-1蛋白分泌虽有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组SCF、SDF-1蛋白分泌水平上调，差异有统计学意义(均P<0.05)，提示补阳还五汤可能通过促进缺氧预适应CFS分泌SCF、SDF-1蛋白进而促进心脏干细胞迁移。

表3 各组细胞培养液中SCF、SDF-1蛋白分泌情况

3 讨 论

急性心肌梗死归属中医学“真心痛”、“厥心痛”的范畴，气虚血瘀为其主要病机。补阳还五汤出自清代王清任之《医林改错》，方由生黄芪120 g，当归尾6 g、赤芍5 g、地龙3 g、川芎3 g、红花3 g、桃仁3 g组成，具有补气活血、祛瘀通络之功效，故在临床上也常用于心肌梗死后气虚血瘀证的治疗。

心肌主要由心肌细胞和CFS组成，心肌细胞是心脏的功能单位，而CFS为心肌细胞提供支架作用，维持心肌的结构，同时还参与维持心脏正常的电生理功能〔6〕。而近年来发现的心脏干细胞具有维持心肌细胞稳态及参与心脏重构作用〔7〕，其一旦被激活，可迅速迁移、分化形成心肌和冠脉血管。因此，促进心脏干细胞向梗死区域迁移至关重要。有研究表明，当冠脉狭窄或痉挛时，其相应的心肌组织处于缺血缺氧状态，可诱导少量心脏干细胞迁移至该区域，并分化为心肌细胞进而促进受损心肌功能的恢复〔8，9〕。本实验通过心脏干细胞迁移试验，发现缺氧24 h预适应的培养液可增加心脏干细胞迁移数，验证了上述研究结论；而补阳还五汤含药血清干预后，心脏干细胞迁移数进一步增多，表明补阳还五汤具有促进心脏干细胞迁移的作用。此外，缺血缺氧可促使心脏成纤维细胞旁分泌一系列迁移相关细胞因子(如SCF、SDF-1等)，而这可能对于心脏干细胞具有一定的趋化作用〔5〕。SCF可与受体c-kit特异性结合，对c-kit+心脏干细胞有强烈趋化作用〔10〕，因此SCF/c-kit在参与心肌梗死初始几个小时内的干细胞动员、迁移中发挥重要作用〔11〕，而这种作用可能是通过活化p38MAPK信号通路实现的〔12〕。SDF-1及其受体CXCR4为促进心脏干细胞迁移的重要因子〔13〕，诸多因子如血管内皮生长因子(VEGF)等对心脏干细胞的迁移作用往往依赖于SDF-1/CXCR4轴的调节〔14〕。Wang等〔15〕证实SDF-1/CXCR4轴通过激活PI3K/Akt通路介导心肌干细胞迁移，实现修复心肌的作用。本实验表明补阳还五汤可能通过上调缺氧预适应CFS中SCF、SDF-1 mRNA表达，增加SCF、SDF-1蛋白分泌，进而促进心脏干细胞迁移。