UC中芳香烃受体AHR的表达及其对IL-17信号效应调控的研究

范丽萍 孙凯 张永为 周康 王剑超★

溃疡性结肠炎（UC）是一种病因不明的直肠或结肠慢性非特异性炎症性疾病，是胃肠道最严重的疾病之一，其发病原因及机制尚不明确。IL-17细胞因子是新发现的一类参与急性和慢性炎症反应的细胞因子，其在UC的发生发展中起到重要作用［1-2］。AHR是一种配体激活的转录因子，属螺旋-环-螺旋（HLH）超家族中的bHLH-PAS亚家族成员。研究发现AHR可以调控Th17细胞和Treg细胞的分化［3］。在动物模型中，AHR的活化能抑制促炎因子的产生，推测AHR可以调控IL-17介导的炎症反应。本资料旨在分析AHR对促炎症相关因子CCL20﹑CXCL2和IL-6产生的影响，以明确AHR介导的炎症效应在UC发生发展中的作用，为AHR作为临床防治UC的一个潜在靶点提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 Hela细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所，在本实验室用DMEM完全培养基常规传代培养。DMEM高糖培养基：购自美国Thermo公司，4℃保存。使用时用10%新生牛血清配制成DMEM高糖完全培养液。胎牛血清：购自杭州四季青生物工程材料研究所，56℃灭活30min，-20℃保存。二甲基亚砜（DMSO）：分析纯，购自美国SIGMA公司。细胞RNA抽提试剂RNAiso plus：购自日本TAKARA公司。RNA逆转录试剂盒﹑rTaq DNA聚合酶﹑实时定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM II（DRR081A）：购自日本TAKARA公司。AHR抗体：购自Proteintech公司。转染试剂lipofectamine 2000：购自美国Invitrogen公司。CXCL2和IL-6 Elisa试剂盒：购自美国eBioscience公司。结肠组织：UC结肠组织和正常的结肠组织来自浙江中医药大学附属第二医院。正常对照结肠组织来自结肠癌患者病理保留的癌旁正常组织。10例UC组织中男5例，女5例；10例正常结肠组织中男6例，女4例。两组患者年龄均为30～50岁。

1.2 实验方法 （1）细胞培养﹑复苏和冻存：Hela细胞用DMEM高糖完全培养基培养在5%CO2﹑37℃及饱和湿度条件下生长及传代，实验时取对数生长期细胞。冻存细胞时应选用对数生长期的细胞，一般一小瓶含8ml培养基的细胞可以冻存2管。离心弃上清液后，加入冻存液（50%新生牛血清+10%DMEM培养基+10%DMSO），分装至无菌冻存管中，密闭冻存管，置于-80℃冰箱过夜，次日再放入液氮罐。（2）细胞总RNA的制备：根据TAKARA RNAiso plus试剂说明进行操作，提取RNA。贴壁细胞直接用PBS洗1次，悬浮细胞离心收集后用PBS洗1次，按照1×107细胞加1ml RNA抽提试剂Trizol，充分混匀后；加入0.2ml氯仿（三氯甲烷）混匀，剧烈震荡使其充分混匀，常温静置10min，4℃，12000 g离心15min；离心时在新EP管上编号，吸取上层水相层于新EP管中，再加入0.5 ml异丙醇颠倒混匀，室温静置 10min后，4℃，12000 g离心15 min；弃上清液，沉淀以预冷的75%乙醇（预先用DEPC水配制）洗涤，4℃，12000g离心 5 min后，弃上清液，再稍微离心，使残余液体集于管底，用小枪头吸净管底的液体，空气干燥；溶解于合适量DEPC水，进行浓度和纯度测定后置于-80℃保存。（3）逆转录反应：按逆转录试剂盒说明书操作。（4）结肠组织AHR免疫组化分析：用甲醛固定24h，石蜡包埋结肠组织，切片和染色按常规步骤处理。程序如下：首先在玻片上标记好肠炎组和正常组，用切片机完成切片，放入烤箱干燥后，用丙酮在室温固定10min，使其在空气中完全干燥脱水，缓冲液洗3min/2次，然后用过氧化物酶阻断剂室温反应5min，以降低内源性过氧化物酶造成的非特异性染色，缓冲液洗5min/2次，然后用一抗稀释液稀释抗AHR抗体（1：50），37℃孵育2h。缓冲液充分洗涤后滴上增强子，室温孵育20min，缓冲液洗5min/2次，加HRP酶标二抗，室温下孵育30min，洗涤后与底物室温作用30min，充分冲洗后镜下观察，结果根据染色情况进行盲评：-（阴性）；+（较弱阳性）；（中等强度染色）；+++（强阳性）。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。所有的实验结果均由三次或者三次以上独立重复的实验得出，比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AHR在UC组织和正常结肠组织中的表达情况 见表1﹑图1。

表1 AHR在正常结肠组织和UC组织中表达的结果［n（%）］

图1 免疫组化显示UC肠上皮细胞中低表达AHR

2.2 活化AHR对IL-17触发的炎性细胞因子的变化 在Hela细胞中用AHR的激活剂10nM FICZ激动剂活化AHR，用DMSO作对照。AHR活化1h后用IL-17（50ng/ml）刺激0h﹑1h﹑3h﹑12h后收集RNA，用RT-PCR的方法检测趋化因子CXCL2﹑CCL20和细胞因子IL-6在mRNA水平的表达变化。发现用FICZ活化后可以抑制IL-17诱导的CXCL2﹑CCL20和IL-6的mRNA水平，见图2。

图2 在Hela细胞中活化AHR抑制了IL-17诱导的细胞因子的产生。观察组和对照组之间采用非配对的t检验，★P＜0．05

2.3 过表达AHR表达对IL-17触发的炎性细胞因子的变化 在Hela细胞中成功转染Flag-AHR表达质粒和空质粒，转染36h后用 IL-17（50ng/ml）刺激0h﹑1h﹑3h后收集RNA，用RT-PCR的方法检测趋化因子 CXCL2﹑CCL20和细胞因子IL-6在mRNA水平的表达变化。发现过表达AHR可以抑制IL-17诱导的CXCL2﹑CCL20和IL-6的产生（如图3）。

图3 在Hela细胞中稳定过表达AHR抑制了 IL-17诱导产生的趋化因子CXCL2、CCL20和细胞因子IL-6（★P＜0．05，★★P＜0．01）

2.4 干扰AHR表达对IL-17触发的炎性细胞因子的变化 采用能够干扰AHR的质粒转染Hela细胞，在Hela细胞中成功转染AHR干扰质粒和空白对照，转染 36h后用 IL-17（50ng/ml）刺激0h﹑1h﹑3h后收集RNA，用RT-PCR的方法检测细胞因子 CXCL2﹑CCL20和IL-6在mRNA水平的表达变化（如图4）。发现用质粒干扰AHR可以促进IL-17诱导的CXCL2﹑CCL20和IL-6 在mRNA的水平的表达。

图4 在Hela细胞中干扰AHR表达促进IL-17诱导的细胞因子的产生（★P＜0．05，★★P＜0．01，★★★P＜0．001）

3 讨论

IL-17，主要来源于Th17细胞，在细菌和真菌感染的防御反应中起着重要的作用，但也能诱导自身免疫性疾病的发生，越来越多的研究已证实，IL-17与UC的发生发展密切相关［4］。有动物实验显示在小鼠DSS诱导的肠炎模型中，IL-17敲除的小鼠发病率和致死率比野生型低，显示了IL-17在肠炎中的病理作用［5］。而IL-17信号通路充分活化的分子及其机制还有待于深入研究。本研究表明AHR参与并抑制了IL-17信号通路，抑制CXCL2﹑CCL20和IL-6的表达，是IL-17信号通路抑制的分子之一。

AHR最初发现是作为二恶英毒性的介导者，包括免疫毒性。持续激发AHR能导致人和动物其他的病理效应。目前发现，AHR在小分子化合物的代谢和免疫中有双重作用，但关于AHR参与机体自身免疫性疾病的具体机制，还有待进一步研究。AHR是配体激活的转录因子，AHR的活化不仅与细胞的增殖﹑分化﹑分泌有关，还与肿瘤的转移和发展有关。现有大量文献研究AHR在免疫系统上的各种不同效应，尤其在Th17细胞的调控上［6］。为了探讨AHR是否参与了IL-17通路的调控，作者选取Hela细胞用FICZ进行AHR活化，然后再用IL-17刺激，观察细胞因子产生的情况。结果发现活化AHR以后抑制了趋化因子CXCL2﹑CCL20和细胞因子 IL-6等炎症细胞因子的mRNA水平，证明AHR参与了IL-17通路传递，抑制了炎症细胞因子的表达。采用过表达AHR的Hela细胞和转染空质粒的Hela细胞进行IL-17刺激实验，显示过表达AHR抑制了CXCL2﹑CCL20﹑IL-6的表达，另外，选取Hela细胞进行AHR干扰，再用IL-17刺激，观察细胞因子产生的情况。结果发现干扰AHR表达以后显著增加了CXCL2﹑CCL20﹑IL-6等炎症细胞因子的mRNA水平，证明AHR参与了IL-17通路传递，抑制了促炎性细胞因子的表达。说明在Hela细胞中过表达AHR能起到负相调控IL-17信号传导的作用。

本研究的体外实验证实AHR能负向调控IL-17信号效应，而IL-17在UC的发生和发展中起重要作用，本资料免疫组化结果显示：10例正常的结肠组织肠上皮细胞全部表达强阳性，而10例UC4例表达强阳性，5例表达中阳性，1例表达弱阳性。说明AHR可能参与了UC的发病过程。另外发现，AHR表达增加，促炎症因子表达受抑制。有文献报道，在肠上皮内，若AHR的活性低，肠道则会处于免疫激活状态，易产生自身免疫性疾病［7］。在DSS诱导的肠炎模型中，AHR的缺失或失活能增加肠炎的免疫病理作用，引起结肠上皮的损伤。AHR在肠上皮细胞间介导的信号通路也有待进一步研究。

［1］ Fujino S, Andoh A, Bamba S, et al． Increased expression of interleukin17 in inflammatory bowel disease． Gut, 2003,52(1):65-70．

［2］ Song X, Qian Y． The activation and regulation of IL-17 receptor mediated signaling．Cytokine, 2013,62(2):175-182．

［3］ Veldhoen M, Hirota K, Westendorf AM, et al． The aryl hydrocarbon receptor links TH17-cell-mediated autoimmunity to environmental toxins． Nature, 2008,453(7191):106-109．

［4］ Zhu S,Qian Y．IL-17/IL-17 receptor system in autoimmune disease: mechanisms and therapeutic potential． Clincal Sci,2012,122(11):487-511．

［5］ Ito R,Kita M,Shin-YaM,et al．Involvement of IL-17A in the pathogenesis of DSS-induced colitis in mice．Biochem Biophys Res Commun, 2008,377(1):12-16．

［6］ Kimura A,Naka T,Nohara K,et al．Aryl hydrocarbon receptor regulates Stat1 activation and participates in the development of Th17 cells． Proc Natl Acad Sci,USA,2008,105(28):9721-9726．

［7］ Li Y,Innocentin S,Withers DR,et al．Exogenous stimuli maintain intraepithelial lymphocytes via aryl hydrocarbon receptor activation．Cell,2011,147(3)629-640．