多西环素对全氟异丁烯吸入性急性肺损伤大鼠的防治效果

黄小春 胡祖良 张源龙 郑敏 赵建 张东泉★

本课题组的前期研究表明，盐酸四环素治疗能够显著改善全氟异丁烯（PFIB）吸入性急性肺损伤，而且能剂量依赖性的抑制肺组织和支气管肺灌洗液（BALF）中MMP-2活性，其中高剂量TET治疗可使肺组织中MMP-2活性降至正常水平［1］。因此针对蛋白分解酶的抑制药物有望在治疗PFIB吸入性肺损伤中发挥作用。由于盐酸四环素的毒性不良反应，目前已在我国近于淘汰，因此，作者选用多西环素于2016年6月至12月通过动物实验研究，观察多西环素（DOX）对PFIB吸入致大鼠吸入性急性肺损伤（ALI）的防治效果，以期为寻求ALI 的有效治疗药物提供线索。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 PFIB（上海有机氟材料研究所，纯度：98%）；BSA224S 分析天平（德国Sartorius 公司）；DOX（纯度99%）。

1.2 方法与分组 （1）实验动物：SPF级Wistar雄性大鼠，体质量180～220g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物实验前先适应性喂养2～3d，自由饮食饮水，每笼饲养6只，于染毒前禁食1夜。180～200g体重 Wistar雄性大鼠。（2）分组：将 36只大鼠随机分为6组，每组各6只，即：正常对照组（NC组），在PFIB染毒后1h，腹腔注射生理盐水（1.0ml/100g）；DOX药物对照组（DOX-C组），在空气暴露后1h，腹腔注射生理盐水（1.0ml/100g）；PFIB+NS组（PFIB-C组），在PFIB染毒后1h，腹腔注射生理盐水（1.0ml/100g）；PFIB+DOX低剂量组（DOX-L组）：在PFIB染毒后1h，腹腔注射低剂量DOX（17.5 mg/kg）；PFIB+DOX中剂量组（DOX-M组），在PFIB染毒后1h，腹腔注射中剂量DOX（35mg/kg）；和PFIB+DOX高剂量组（DOX-H组），在PFIB染毒后1h，腹腔注射高剂量DOX（70mg/kg）。染毒前及染毒后24h称量动物体质量并记录。（3）大鼠动态吸入PFIB 周身暴露的染毒方法：大鼠动态吸入PFIB 周身暴露染毒装置及PFIB染毒浓度的测定方法详见文献［2］。

1.3 观测指标 （1）肺系数测定：在PFIB染毒后24h，将实验动物麻醉后，经腹主动脉放血处死。待血液排净后，打开胸腔，分离出气管并于气管分叉处结扎右支气管，将右气管连同全肺及右肺副叶全部取出，剔除肺外组织，生理氯化钠漂洗，滤纸吸干后测量湿肺净重。计算肺系数：湿肺/体比=（湿肺净重/体质量）×10000。（2）BALF的制备及蛋白和磷脂含量测定：如上所述，在取出右肺后，经左支气管插管，参照文献［2］所述方法制备BALF。Lowry法测BALF中总蛋白含量，采用Wako公司磷脂试剂盒测定磷脂含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFIB染毒前后大鼠肺组织大体病理学观察 在PFIB亚致死剂量染毒后24h，解剖动物时，肉眼可见，PFIB对照组受试动物全肺呈现弥漫性水肿﹑瘀血表现，而在PFIB染毒后1h给予DOX治疗的大鼠肺部瘀血﹑水肿等表现随着DOX给药剂量增加，逐渐减轻，但肺体积仍较正常对照组大（见图1），多西环素治疗PFIB染毒大鼠肺组织病理切片-HE染色（见图2）。

图1 DOX治疗PFIB染毒后大鼠肺组织照片

图2 DOX治疗PFIB染毒大鼠肺组织病理切片-HE染色照片（20倍物镜）

2.2 DOX治疗对PFIB吸入性肺损伤的作用-肺质量和肺系数结果 在DOX给药剂量为17.5～70 mg/kg的范围内，随着给药剂量的增加，DOX可以剂量依赖性的降低湿肺重﹑湿肺体比，且以70 mg/ kg的治疗效果最佳（见图3）。

2.3 DOX治疗对PFIB吸入性肺损伤的作用- BALF中蛋白和磷脂含量的变化 BALF中蛋白质和磷脂含量变化与肺质量变化相似，即在DOX给药剂量为17.25～70 mg/kg的范围内，DOX治疗组能够显著降低BALF中蛋白质和磷脂含量，而且具有显著的剂量依赖性（见图4）。

图3 DOX治疗PFIB染毒大鼠的肺质量与肺系数变化（0．01＜★★P＜0．001）

图4 DOX治疗PFIB染毒大鼠的肺匀浆及BALF中蛋白磷脂含量的变化（0．01＜★★P＜0．001；★★★P＜0．001）

3 讨论

多西环素，一种化学修饰的四环素，其特异性的增强和保留了非抗生素的作用，具有免疫调节﹑抑制细胞因子合成，还可诱导多种肿瘤细胞凋亡，并且也是一种广谱的基质金属蛋白酶抑制剂［3-4］。氟聚合物是工业生产过程中一种常见的副产物，PFIB是全氟丁烯的一种异构体，多见于火灾等意外事故生成的有毒烟雾中，可穿透防毒面具［5］。研究表明，PFIB少量吸入即可产生ALI，严重者可出现肺水肿乃至死亡［6］。研究还表明，蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡在ALI发病过程中具有重要的作用和地位［7］。主要是ALI时肺局部聚集的中性粒细胞释放过量的蛋白分解酶如基质金属蛋白酶（MMPs）和炎性因子如NF-kB﹑IL-1和TNF-α等所致。

PFIB吸入性肺损伤是由于中性粒细胞在肺内聚集﹑活化，释放蛋白酶﹑细胞因子，从而导致血管通透性增加，损伤肺泡上皮屏障，导致Ⅰ型﹑Ⅱ型肺泡细胞的损伤坏死，肺气血屏障通透性升高，形成肺损伤，进而发展成为肺水肿。研究显示在急性肺损伤组织中被激活的炎症细胞释放的各种组织损伤因子中，MMPs被认为与ALI 密切相关。DOX是胶原酶和明胶酶的强效抑制剂。Wang J等［8］在H2S诱导的ALI模型中发现DOX可以通过抑制MMP-2和MMP-9活性，从而减轻ALI。Ng HH等［4］在流感病毒导致的ALI模型中发现DOX减少炎症反应，抑制MMPs表达，从而减轻ALI。在本研究中肺湿干重比是反映肺组织损伤程度的良好指标，联合BALF中蛋白质含量更能反映肺损伤的严重程度。从数值上看，DOX治疗组的肺系数﹑BLAF蛋白质和磷脂含量显著低于PFIB-C组，以高剂量差异显著，提示高剂量DOX可以减轻PFIB 诱导的ALI的病变严重程度，减少ALI时的蛋白渗出，并抑制炎症反应。

综上所述，蛋白酶抑制剂DOX可减轻PFIB吸入性ALI，降低ALI 的严重程度，其机制可能预期是蛋白酶抑制剂能降低肺泡毛细血管通透性，减轻肺泡上皮屏障损伤，减少ALI 时的蛋白渗出，并抑制ALI 时炎症介质释放，减轻失控性的炎症反应有关。对于寻找专一性较强的酶抑制剂，将会明显提升PFIB 吸入性肺损伤的防治能力，并有利于推进PFIB ALI发病机制的研究。

［1］ 赵建,丁日高,阮金秀,等．盐酸四环素对全氟异丁烯吸入性肺损伤的防治效果研究．中国职业医学,2005,1:14-17．

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［3］ 陈薇,付翔,黄鹂莺姿,等．多西环素抑制金属蛋白酶药理作用及机制研究进展．中国药师,2015,18(3):482-484．

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［6］ Luh SP,Chiang CH．Acute lung injury/acute respiratory distress syndrome(ALI/ARDS): the mechanism, present strategies and future perspectives of therapies．J Zhejiang Univ Sci B,2007,8(1):60-69．

［7］ Davey A,McAuley DF,O'Kane CM．Matrix metalloproteinases in acute lung injury: mediators of injury and drivers of repair．Eur Respir J,2011,38(4):959-970．

［8］ Wang J, Zhang H, Su C, et al． Dexamethasone ameliorates H(2)S-induced acute lung injury by all eviating matrix metalloproteinase-2 and -9 expression．PLoS One, 2014, 9(4): e94701．