黄芪多糖对大鼠T淋巴细胞顺铂处理后自噬的影响

王楠 陆金华 林胜友★

黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分之一，具有介导宿主免疫反应，对抗化疗引起的免疫抑制，提高宿主免疫力，降低化疗药物对机体伤害作用等功能［1-2］。T淋巴细胞介导的细胞免疫是肿瘤免疫的主要组成部分，而采用化疗药物治疗会对T淋巴细胞产生一定的毒害作用，影响细胞免疫［3-4］。细胞凋亡和自噬都是生物体内高度保守的生物过程，而这两个通路中有部分成分可以相互作用，同时可以被相同的刺激诱导发生。化疗药物能够增强机体T淋巴细胞的自噬，同时引起T淋巴细胞凋亡。本资料主要拟研究黄芪多糖对大鼠T细胞顺铂处理后自噬相关基因mRNA与蛋白表达以及细胞凋亡的影响，探究黄芪多糖是否能够对顺铂引起的T细胞自噬和凋亡产生抑制作用，对抗化疗引起的T细胞损伤。

1 材料和方法

1.1 实验器材 试剂：黄芪多糖标准品购自上海源叶生物有限公司，顺铂注射液购自Hospira（H20090521），RPMI 1640（Gibco），Fetal Bovine Serum（Gibco），1%青霉素-链霉素混合液（Hyclone公司），Quick Start™ Bradford Protein Assay（BioRad 公 司 ），anti-CD3 APC，anti-CD4 PE，anti-CD8 FITC均购自CST，Anti-GAPDH （Sigma：G8795），Anti-Caspase3 （CST：9662），Anti-Class I PI3K （SantaCruz：SC7189），Anti-Class III PI3K （SantaCruz：SC134986），Anti-Apg5 （SantaCruz：SC33210），Anti-Beclin1 （CST：3459），Anti- mTOR （SantaCruz：SC8319），Anti-LC3I/II（Sigma：L7543），Goat anti-Rabbit IgG-HRP（Life Tech公司），TRIzol试剂（Invitrogen），PrimeScriptTM RT Master Mix （Takara），Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（RPN2236）；Annexin V-FITC（Cell signaling）。仪器：CFX Connect Real-Time System（Biorad）；NanoDrop 2000（Thermo Scientific公 司 ）；二氧化碳培养箱（Thermofisher）；全波长酶标仪（SpectraMax Plus 384型，美国MD）；Mini-Proten Tetra System（Bio-RAD）。

1.2 大鼠脾脏T淋巴细胞分离和培养 取6～8周龄SD大鼠，在无菌条件下取脾脏，采用手术剪将其剪至5mm×5mm小块，并用载玻片研碎，加入PBS制作成脾脏细胞悬液，采用200目筛过滤，收集单细胞滤液并采用1500rpm离心5min沉淀细胞，采用PBS重悬后滴加至等体积的淋巴细胞分离液中，1900rpm水平离心20min，收取淋巴细胞层，加入5倍体积细胞洗涤液漂洗，1500rpm离心5min并收集淋巴细胞沉淀，采用RPMI1640加10%FBS及1×青链霉素混合液重悬细胞，调整细胞密度至1×106/ml，5% CO2条件下37℃恒温湿式培养。

1.3 流式细胞术检测T细胞类型及细胞凋亡 T细胞类型检测：取新分离的大鼠脾脏T淋巴细胞，细胞计数后400g离心3min收集50万细胞，采用100μl 1%BSA重悬细胞，加入anti-CD3 APC，anti-CD4 PE，anti-CD8 FITC各2.5μl，混匀后4℃孵育30min，再加入1ml预冷的PBS洗去多余抗体，400g离心5min，再加入300μl PBS重悬细胞，采用BD FACSCalibur流式细胞仪检测anti-CD3 APC，anti-CD4 PE，anti-CD8 FITC，收集1万个细胞信号，并采用FlowJo 7.6进行数据分析。细胞凋亡检测：取新分离的大鼠脾脏T淋巴细胞1×107个，分别采用（1）等体积的PBS。（2）625μg/ml的黄芪多糖。（3）40μm的顺铂。（4）40μm顺铂加625μg/ml的黄芪多糖处理24h，离心收集细胞，计数，取50万个细胞采用100μl 1%BSA重悬，加入Annexin V-FITC 2.5μl，Propidium Iodide （PI）1μl在4℃双染30min，再加入1ml预冷的PBS洗去多余抗体，400g离心5min，再加入300μl PBS重悬细胞，采用BD FACSCalibur流式细胞仪检测Annexin V-FITC，Propidium Iodide，采用FlowJo 7.6进行数据分析。

1.4 荧光定量PCR 取新分离的大鼠脾脏T淋巴细胞4×107个，按1.3方法处理12h和24h，离心收集细胞。采用TRIzol试剂（Invitrogen）提取淋巴细胞总RNA，并用NanoDrop 2000对提取的RNA进行定量。采用PrimeScriptTM RT Master Mix （Takara）进行cDNA合成。荧光定量PCR试剂盒为SuperReal PreMix Color（SYBR Green），在CFX Connect Real-Time System（96孔）上进行qRT-PCR反应并用BIO-RAD CFX Manager 3.1进行数据分析，反应程序为：50℃ 2min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循环40次。采用GAPDH基因作为内参，每个样品测定3次，目的基因表达量变化采用与GAPDH基因循环阈值比较进行确定。

1.5 免疫印迹实验 取新分离的大鼠脾脏T淋巴细胞3×107个，按1.3方法处理12h和24h，离心收集细胞。采用100μl IP裂解液裂并加入蛋白酶抑制剂cocktail（Roche公司）4℃裂解过夜，在4 ℃ 13000rpm离心30min收集含蛋白上清液，采用Quick Start™ Bradford Protein Assay进行蛋白定量，最后调整蛋白浓度为2μg/μl后冻存在-80℃备用。Western blot垂直电泳条件为10% Gel，上层胶80V，下层胶120V，转膜条件为80V 100min，封闭液为5% non-fat milk（Biorad公司），一抗为Anti-TUBULIN （SantaCruz：SC5286），Anti-Caspase3 （CST：9662），Anti-Class I PI3K （SantaCruz：SC7189），Anti-Class III PI3K （SantaCruz：SC134986），Anti-Atg5 （SantaCruz：SC33210），Anti-Beclin1 （CST：3459），Anti- mTOR （SantaCruz：SC8319），Anti-LC3I/II（Sigma：L7543），二抗为Goat anti-Rabbit IgG-HRP（Life Tech公司），显色液为Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（RPN2236）。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（）表示，采用独立样品t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脾脏T淋巴细胞的分离和鉴定 取6～8周龄SD大鼠脾脏，研磨后采取淋巴细胞分离液分离淋巴T细胞，采用流式细胞术鉴定，结果如图1所示，分离得到CD3+淋巴细胞占总细胞比例为67.9%，其中CD3+CD4+T淋巴细胞比例为27.9%，CD3+CD8+T淋巴细胞比例为64.2%。

2.2 黄芪多糖对顺铂处理后T淋巴细胞自噬相关基因表达影响 取新鲜分离的大鼠脾脏T淋巴细胞，分为空白对照组（加等体积的PBS），顺铂组（加40μm的顺铂），黄芪多糖组（加625μg/ml的黄芪多糖），黄芪多糖顺铂组（40μm顺铂加625μg/ml的黄芪多糖处理），分别处理12h和24h，离心收集细胞，提取总RNA进行荧光定量PCR检测mTOR﹑ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑Atg5﹑Beclin1的表达量。结果见表1﹑2。

表1 药物处理12h后大鼠脾脏T淋巴细胞自噬相关基因表达变化［n=3，（）］

表1 药物处理12h后大鼠脾脏T淋巴细胞自噬相关基因表达变化［n=3，（）］

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 ATG5 ClassⅢ PI3K ClassⅠPI3K mTOR Beclin1空白对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00顺铂组 1.35±0.05 * 3.21±0.18 ** 2.55±0.13** 1.95±0.12** 1.75±0.08**黄芪多糖组 0.95±0.04 1.18±0.09 1.23±0.07 1.11±0.09 1.05±0.06顺铂黄芪多糖组 1.16±0.04 *# 2.56±0.13 **## 1.78±0.15**# 1.43±0.08*# 1.35±0.07*#

表2 药物处理24h后大鼠脾脏T淋巴细胞自噬相关基因表达变化［n=3，（）］

表2 药物处理24h后大鼠脾脏T淋巴细胞自噬相关基因表达变化［n=3，（）］

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 ATG5 ClassⅢPI3K ClassⅠPI3K mTOR Beclin1空白对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00顺铂组 2.95±0.24** 3.56±0.23** 2.41±0.15** 3.45±0.26** 2.86±0.19**黄芪多糖组 0.93±0.05 1.12±0.08 1.21±0.08 1.02±0.05 1.01±0.05顺铂黄芪多糖组 1.38±0.06*# 3.08±0.19**## 2.14±0.25**## 1.67±0.11**## 1.85±0.15**##

2.3 黄芪多糖对顺铂处理后T淋巴细胞自噬相关蛋白表达影响 如图2所示，顺铂处理T淋巴细胞12h或24h后，自噬相关蛋白Atg5﹑Beclin1﹑LC3表达量明显上升，同时凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白表达也明显上升，而ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR蛋白表达下降，表明顺铂处理导致T淋巴细胞自噬和凋亡增加。采用黄芪多糖处理T淋巴细胞后相关蛋白表达变化不明显，而顺铂加黄芪多糖处理T淋巴细胞12h和24h后，自噬相关蛋白Atg5﹑Beclin1﹑LC3表达明显低于顺铂组，同时凋亡相关蛋白Caspase-3表达也明显降低，而ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR表达上升，表明黄芪多糖能够抑制顺铂导致的T淋巴细胞自噬和凋亡。

图1 大鼠脾脏T淋巴细胞鉴定结果

2.4 黄芪多糖对顺铂处理后T淋巴细胞凋亡的影响 如图3所示，在Annexin V-FITC 和Propidium Iodide （PI）双阳性的细胞中，顺铂组双阳性细胞比例为15.8%，正常对照组为5.55%，黄芪多糖组为8.77%，顺铂黄芪多糖组为11.2%，表明黄芪多糖能够改善顺铂引起的T细胞凋亡发生。

图2 黄芪多糖对顺铂处理后T淋巴细胞自噬相关蛋白表达影响

图3 黄芪多糖对顺铂处理后T淋巴细胞凋亡的影响

3 讨论

越来越多的证据表明，细胞自噬和凋亡可以相互作用，拮抗或者协同，影响细胞命运，自噬和凋亡相关的关键分子存在交叉及相互作用。Insulin-IGF-1信号减弱，营养或能量限制等细胞代谢压力会导致mTOR活性下调，引起mRNA转录抑制以及自噬，同时mTOR的下游分子还包括p53，BAD和BCL-2等凋亡相关分子。Beclin 1是酵母Atg6基因的同系物，多方面证据显示Beclin 1参与了自噬和凋亡的相互作用，研究表明Beclin 1和抗凋亡相关蛋白BCL-2，BCL-XL之间有功能上和结构上的相互作用［5-6］。细胞凋亡引起的Caspase激活可以裂解Beclin 1和PI3K等。前期研究表明，T淋巴细胞在化疗药物作用后，会产生过多的自噬，并且凋亡也会增加。

本研究通过分离大鼠脾脏T淋巴细胞并在体外培养，采用黄芪多糖和顺铂处理，研究黄芪多糖对顺铂引起的T淋巴细胞自噬和凋亡的影响。结果表明，顺铂能够引起T淋巴细胞自噬相关基因mTOR﹑ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑Atg5﹑Beclin1的mRNA表达上升，并且处理24h上升效果明显高于12h，而采用黄芪多糖加顺铂处理后，自噬相关基因的mRNA表达量与空白对照组相比仍然有上升，但是与顺铂组相比，其自噬相关基因mRNA的表达量明显下降，表明黄芪多糖对顺铂引起的T淋巴细胞自噬相关基因表达具有抑制作用。在Western blot检测中，采用顺铂处理后自噬相关蛋白Atg5﹑Beclin1﹑LC3和凋亡相关蛋白Caspase-3均有明显升高，同时ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR表达降低，而在加入黄芪多糖后，Atg5﹑Beclin1﹑LC3﹑Caspase-3表达与顺铂组相比有不同程度下降，而ClassI PI3K﹑ClassIII PI3K﹑mTOR表达上升，表明黄芪多糖对顺铂引起的T细胞自噬相关蛋白表达有抑制作用，同时对细胞凋亡也有抑制。通过流式细胞检测发现Annexin V-FITC 和Propidium Iodide（PI）双阳性凋亡细胞在顺铂处理后明显多于正常对照组，而加入黄芪多糖后明显降低，表明黄芪多糖可以降低顺铂引起的T细胞凋亡。

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