α3神经型尼古丁受体基因上调对SH-SY5Y细胞突触素水平的影响

吕园园， 齐晓岚， 李 毅， 官志忠， 张 力

在神经系统中，突触是神经元与神经元之间发生功能联系的主要部位[1]，也是信号传导的枢纽。突触作为神经系统的结构=基础，在人的学习记忆、应激、认知能力方面表现出强大的可塑性。突触丢失意味着突触可塑性的丧失以及信号转导的中断，致使学习记忆能力和认知功能障碍[2]。阿尔茨海默病是一种神经元退行性变疾病，表现为记忆障碍、认知能力衰退、智力和理解能力减弱。尽管AD的主要病理学改变是Aβ沉积形成的老年斑和神经元纤维缠结，但近年的研究结果表明突触丢失是其认知功能低下的主要危险因素之一，在认知功能障碍早期就已经出现，而且先于Aβ沉积形成的老年斑和神经元丢失[3,4]，但引起AD脑中突触丢失及功能低下的具体机制目前还不十分清楚。突触相关蛋白对于维持突触功能和形态具有重要作用。因此，研究突触相关蛋白的改变对于阐明AD的发病机制及病情的转归显得十分重要。目前许多突触相关蛋白已经得到验证，具有标志性的蛋白突触素(synaptophysin,SYP)可作为评估突触功能的特异性标志物之一。

本课题组前期研究表明α3 nAChR具有一定的神经保护作用。因此，本课题通过转染α3 nAChR-pcDNA3.1来研究α3 nAChR表达的变化对SYP的影响，进而探讨AD发病的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购于ATCC公司；高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶液、双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)购于HyClone公司；胎牛血清(FBS)购于Gibco公司；BamHI、Hind III购于大连宝生物工程有限公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent、Firststart Universal SYBR Green Master (Rox)、Genopure Plasmid Midi Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 均购于Roche公司；Trizol试剂、BCA蛋白定量分析试剂盒、蛋白Marker均购于Thermo公司(美国)；α3 nAChR、β-actin、SYP上下游引物由上海生物工程有限公司设计并合成；鼠抗α3 nAChR单克隆抗体(sc-365479)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠二抗(sc-2005)均购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；鼠抗Synaptophysin单克隆抗体(ab8049)购于美国Abcam公司；鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(#M20010)购于上海艾比玛特生物医药有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司；WB其他相关试剂购于Amersham公司。普通试剂购于Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 α3 nAChR-pcDNA3.1表达质粒的构建 按照GenBank提供的基因序列，利用Ambion公司官网提供的软件来设计α3 nAChR引物序列，序列如下：α3 nAChR上游引物： 5’-CCCAAGCTTATGGGCTCTGGCCCGCTCTC-3’；α3 nAChR下游引物：5’-CGCGGATCCTCATAGCCCAGGTTCTTGATCGGAT-3’。上述序列用Blast Search检测确定与α3 nAChR基因以外的人类已知序列无同源性，此引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。其5’、3’末端含有两个限制性酶切位点，分别是BamHI和Hind III。运用逆转录PCR获取人α3 nAChR基因，其序列大小为1470 bp，电泳鉴定并回收。利用T4 DNA连接酶将其连接至载体pcDNA3.1上，构建质粒重组体α3 nAChR-pcDNA3.1，空载质粒为pcDNA3.1。用大肠杆菌DH5α做转化，罗氏的去内毒素质粒DNA提取试剂盒(中提)提取重组质粒，双酶切过夜，根据电泳结果鉴定酶切片段大小，双向测序鉴定碱基序列和方向。

1.2.2 细胞培养和瞬时转染 用完全培养基(含15%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基)于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的恒温条件下培养SH-SY5Y细胞，当细胞生长良好时，消化并传代于六孔板中，此时用含15%胎牛血清不含双抗的DMEM高糖培养基培养。当细胞汇合度达70%～80%时,按照本课题组前期优化的转染条件(转染试剂：质粒为3∶1)进行转染[5]，设置对照组、空载质粒组和实验组。转染6 h后更换不含双抗的培养基继续培养，48 h后收集细胞，测定α3 nAChR mRNA及蛋白的表达水平。实验每次3个复孔，重复3次。

1.2.3 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测α3 nAChR、SYP mRNA表达情况 采用Trizol一步法提取SH-SY5Y细胞总RNA，再以总RNA为模板，运用RT-PCR逆转录合成cDNA，然后进行Real-time PCR，以cDNA为扩增模板。运用Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒，α3 nAChR、SYP、β-actin引物序列(见表1)，在ABI Prism 7300型实时荧光定量PCR仪上收集待测基因及内参照β-actin扩增循环的荧光信号，用Applied Biosystems SDS2.1软件对数据进行分析。以β-actin 为内参照分析结果，并计算α3 nAChR、SYP的mRNA相对表达水平(RQ=2-△△Ct)，并对其结果进行统计学分析。实验每次3个复孔，重复3次。

1.2.4 蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)检测α3 nAChR、SYP的蛋白表达水平 向六孔板中加入裂解液，用细胞刮收集并提取细胞总蛋白，用BCA法定量蛋白。WB法检测α3 nAChR、SYP蛋白的表达情况，以β-actin作为内参照。灰度值用Image J软件进行分析，计算α3 nAChR、SYP蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度值的百分比作为蛋白表达水平。实验每次3个复孔，重复3次。

1.3 统计学分析 用SPSS 22.0软件分析数据并进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差不齐时改用Dunnett’s T3校正检验。P<0.05表示实验结果的差异有统计学意义。

表1 待测基因的引物序列及扩增产物大小

2 结 果

2.1 α3 nAChR-pcDNA3.1质粒构建的鉴定 将α3 nAChR-pcDNA3.1重组质粒用BamHI和Hind III 进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在约1500 bp和5000 bp处出现两个条带(见图1)。将重组质粒进行DNA序列测定得到的结果与实验设计的模板核苷酸序列一致(见图2)，说明α3 nAChR基因上调的表达质粒构建成功。

2.2 转染后α3 nAChR mRNA及蛋白的表达水平 用Real-time PCR和WB方法检测SH-SY5Y细胞转染α3 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒后α3 nAChR mRNA及蛋白的表达水平分别增加了422%(见图3A)和106%(见图3B)，与空载质粒组及对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。而空载质粒组pcDNA 3.1与对照组相比无统计学意义。表明已经将α3 nAChR-pcDNA 3.1质粒成功的转入到细胞中，并且增加了α3 nAChR mRNA和蛋白的表达水平；而空载质粒不影响α3 nAChR的表达水平。

2.3 转染后SYP mRNA及蛋白的表达水平 用Real-time PCR和WB方法检测对照组、空载质粒组和上调组的结果显示，SH-SY5Y细胞α3 nAChR上调后SYP mRNA及蛋白的表达水平增加了115%(见图4A)和43%(见图4B)，差异具有统计学意义(P<0.05)。而空载质粒组与对照组相比SYP mRNA及蛋白的表达水平均无明显差异

M：DNA Marker (DL 5000)；1、2、3、4泳道：α3 nAChR-pcDNA3.1重组质粒酶切样品

图1 α3 nAChR-cDNA3.1重组质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图

图2 α3 nAChR 核苷酸序列测序峰图

与对照组相比差异有统计学意义**P<0.05

图3 SH-SY5Y细胞转染后α3 nAChR mRNA(A)及蛋白(B)的表达水平

与对照组相比差异有统计学意义**P<0.05

图4 SH-SY5Y细胞转染后SYP mRNA(A)及蛋白(B)的表达水平

3 讨 论

AD是一种与年龄和遗传等许多因素相关的疾病，并以每20 y翻一倍的速度在增加，给社会和家庭带来沉重负担[6]。因此对AD的研究以及寻找药物治疗靶点已经成为研究的热点。研究发现，胆碱能系统功能降低在AD早期阶段已有表现，在AD的发生发展中有一定作用[7]。胆碱能系统中的神经型尼古丁受体(Neuronal nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)在大脑的学习、认知及记忆功能方面有一定的调节作用，并参与许多信号传递的调控。nAChR由α和β两种亚基组成，不同种类的亚基以不同的形式组成不同的五聚体结构，主要调节细胞内外Ca2+、K+、Na+等离子的流动，其表达量的改变与Aβ呈负相关，在AD的发展中起关键的调控作用[8]。本课题组前期研究发现[9]，AD患者与正常同年龄对照组相比，α3亚基在大脑皮质和海马区分别减少了35%和29%；α4亚基在海马区和大脑皮质中分别减少了35%和47%；α7亚基在海马中减少了36%。由此可见，在AD患者脑组织中，胆碱能系统中的nAChR严重受损，通常会使学习记忆能力严重受损。因此，在AD的多种发病机制中nAChR数量的改变越来越引起学者的关注。而α3 nAChR是nAChR家族的主要成员之一，对乙酰胆碱和尼古丁具有重要的调节作用；α3 nAChR可对抗Aβ的毒性而起到神经保护作用[10]，而在AD患者的脑组织中也检测到α3 nAChR表达量降低[11]，这提示了α3 nAChR可能在AD的发生发展中发挥一定的作用。

突触可塑性是指突触的功能和结构发生改变的特性，是学习记忆形成的基础；伴随人体机能逐渐降低及神经退行性疾病的发生发展可见突触的数量和面积显著减少，神经网络联结变的稀疏[12,13]。通过对AD患者的标本检测发现了患者脑内多种突触相关蛋白表达含量降低，说明突触的功能发生了改变[14]。SYP是一种与突触功能和结构密切相关的钙结合膜蛋白，主要分布于神经细胞轴突末端的突触囊泡膜上，参与突触重塑，常被作为突触可塑性的特异性标志物[1]。通过对SYP染色的定量和定位，可准确的反映出突触的密度和增生情况，从而推测突触的数量和分布情况[15]。研究发现在AD患者大脑中检测出SYP表达水平下降[16]，这可能与SYP参与神经递质释放、影响突触可塑性有关[17]。SYP表达量的改变在AD的发病中可能起到十分重要的作用。

本实验成功构建了α3 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒体，通过瞬时转染的方法使SH-SY5Y细胞α3 nAChR的表达量增加。实验结果表明，当α3 nAChR表达上调时可使SYP的表达量增加，可能是因为α3 nAChR表达量的增加反馈性调节神经递质合成和释放的增加，促使突触囊泡增多，从而使突触信息传递增强，延缓了AD的发生发展。因此，α3 nAChR在AD的发病机制中非常重要，但其明确的机制目前还不清楚，需进一步的研究。

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