金华地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型及耐药基因位点突变类型分析

刘颖 朱以军 王月

金华地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型及耐药基因位点突变类型分析

刘颖 朱以军 王月

目的 分析金华地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布特征及HBV耐药基因位点突变情况，并探讨两者的关系。方法 选取104例经核苷（酸）类似物治疗的慢性乙型肝炎患者为研究对象，采用Sanger双脱氧法测序技术检测患者血清HBV的基因型和10种常见的HBV P区耐药基因位点突变情况，并分析两者关系。 结果 本组慢性乙型肝炎患者中，HBV B基因型占46.15%，C基因型占53.85%，未发现其他基因型。检测出发生耐药基因位点突变61例，突变率为58.65%，其中C基因型占65.57%，B基因型占34.43%。HBV P区耐药基因位点突变率最高的为M204V/I（73.85%），其次为L180M（36.92%）和A181V/T（23.08%）。HBVP区耐药基因发生单位点突变的占50.82%，其中M204I突变类型最多（29.51%）；发生多位点突变的占49.18%；以M204I和M204V/I+L180M两种突变类型最常见。HBVC基因型的患者耐药基因突变率高于B基因型的患者（71.43%vs 43.75%，P＜0.05），其中C基因型的患者A181V/T位点突变率高于B基因型的患者（14.29%vs 2.08%，P＜0.05）。 结论 金华地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型以B、C基因型为主；HBV P区耐药基因位点突变类型以M204I和M204V/I+L180M两种类型最常见；HBV C基因型的患者比B基因型的患者更易发生耐药突变，且更易发生A181V/T位点突变。

慢性乙型肝炎 耐药突变 基因型 核苷（酸）类似物

HBV感染呈世界性流行，WHO估计全世界约有3.5～4亿人感染HBV[1]。我国是一个肝炎大国，据2006年全国乙型肝炎流行病学调查数据显示，我国1～59岁一般人群HBsAg携带率为7.18%，5岁以下儿童的HBsAg携带率为0.96%。据此推算，我国现有慢性HBV感染者约9 300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2 000万人[2-3]。目前HBV已发现有A～I 9个基因型，在我国以C基因型和B基因型为主。研究表明，HBV基因型与疾病进展和干扰素（IFN）α治疗效果有关；与C基因型感染者相比，B基因型感染者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌；HBeAg阳性患者对IFNα治疗的应答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型[1]。慢性乙型肝炎抗病毒治疗的药物主要为两大类：IFN和核苷（酸）类似物（NAs）。目前临床上应用的抗HBV的NAs有5种：拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定和替诺福韦酯。随着NAs长期广泛的应用，HBV反转录酶（RT）基因的突变也明显增加，使慢性乙型肝炎的抗病毒治疗变得更为复杂。因此，本研究探讨金华地区HBV基因型分布和慢性乙型肝炎患者HBV P区耐药基因突变情况，以期为临床慢性乙型肝炎抗病毒治疗提供参考，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年10月至2016年10月本院收治的慢性乙型肝炎患者104例，其中男77例，女27例；年龄22～69（42.8±12.1）岁。所有患者均符合2011年中华医学会肝病学和感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准，且所有患者都有NAs抗病毒治疗的用药史。

1.2 仪器和试剂 ABI3500测序仪（美国ABI公司）、PCR扩增仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、高速低温离心机（美国Thermo scientific公司，型号FRESCO 17）、凝胶成像分析仪（美国BIO-RAD公司，型号ChemiDoc XRS+）、琼脂糖凝胶电泳仪（美国BIO-RAD公司）。病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、普通DNA纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、HBV耐药基因突变检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）、PCR扩增试剂（日本TaKaRa公司，型号PrimeSTAR HS PREMIX）。

1.3 标本采集 采用促凝分离胶真空采血管采集患者外周血3ml，离心后将血清转移到1.5ml离心管中冷冻保存备用。

1.4 HBV P区耐药基因突变位点 包括10个位点：I169T、V173L、L180M、A181V/T、T184A/G/S/I/L/F、A194T、S202G/I、M204V/I、N236T、M250V/L/I。该10个位点均为国内外临床公认，且为美国FDA批准用于治疗HBV的所有NAs的耐药突变相关位点。

1.5 HBV基因型和HBV P区耐药基因检测 HBV P区耐药基因检测采用Sanger双脱氧法测序技术，使用HBV耐药基因突变检测试剂盒进行。PCR扩增出HBV P区基因，扩增产物经凝胶电泳鉴定和纯化后，进行测序PCR，将测序PCR产物纯化后在ABI3500测序仪上进行测序。最后将测序得到的基因序列在CelLoud平台数据库进行比对，得到HBV基因型和耐药突变位点。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV基因型分布 本组慢性乙型肝炎患者中B基因型有48例，占46.15%；C基因型有56例，占53.85%；未检测到其他类型的基因型。

2.2 HBV P区耐药基因检测结果 本组慢性乙型肝炎患者中有61例检测到耐药基因突变，突变率为58.65%。在所检测的10个突变位点中有9个位点检测到突变：L180M、A181V/T、T184A/G/S/I/L/F、S202G/I、M204V/I、N236T、M250V/L/I、V173L、I169T；A194T位点未检测到突变。HBV P区耐药基因位点突变率情况见图1，突变类型见表1。

图1 HBV P区耐药基因位点突变率情况

由图1可见，HBV P区耐药基因位点突变率最高的为M204V/I，其次为L180M，第3为A181V/T。

由表1可见，HBV P区耐药基因发生单位点突变的有31例（50.82%），其中M204I突变类型最多；发生多位点突变的有30例（49.18%）；未检测到L180M位点单突变，L180M突变伴随M204V/I突变出现。

2.3 HBV基因型与HBV P区耐药基因位点突变类型的关系 见表2。

由表2可见，HBV B基因型的患者与C基因型的患者P区耐药基因突变率比较有统计学差异（P＜0.05），C基因型的患者高于B基因型的患者；其中C基因型的患者A181V/T位点突变率高于B基因型的患者（P＜0.05）。

3 讨论

目前已发现HBV基因型有A～I 9种基因型，我国主要以B基因型和C基因型为主。HBV基因型分布具有明显的地理差异，我国北方以C基因型为主，我国南方以B基因型为主[4-6]。本组104例慢性乙型肝炎患者中，B基因型有48例，占46.15%；C基因型有56例，占53.85%，未发现其他基因型。这说明金华地区HBV基因型以B型和C型为主，C基因型略高于B基因型。这可能与金华地区流动人口较多有关。马幼丽等[7]的研究结果提示浙江HBV基因型以C基因型为主。

表1 HBV P区耐药基因位点突变类型

表2 HBV基因型与HBVP区耐药基因位点突变类型的关系[例（%）]

HBV P区位点的基因突变是HBV对NAs发生耐药的重要原因之一。本研究结果显示，在104例慢性乙型肝炎患者中，有61例患者发生了不同程度的HBV P区耐药基因突变，突变率为58.65%。其中发生单位点突变有31例，多位点突变有30例。突变率最高的突变位点是M204V/I位点，突变率为73.85%，其次是L180M位点，但是L180M突变是伴随M204V/I突变出现，未检测到L180M单位点突变。这与文献报道的结果相一致[8-9]。有研究指出L180M这个位点的伴随性突变能够增强HBV的复制能力，同时抵抗拉米夫定的病毒抑制作用[10]。本研究中HBV P区耐药基因突变模式多样，61例发生HBV P区耐药基因突变的慢性乙型肝炎患者中，有30例（49.18%）患者发生多位点突变。这提示，金华地区慢性乙型肝炎的患者发生HBV P区耐药基因突变率较高且易发生多位点耐药基因突变；在发生A181V/T位点突变中，C基因型患者的突变率明显高于B基因型。

《HBV耐药专家共识：2009年更新》中指出拉米夫定常见耐药相关变异为204I/V±rtLl80M，其中rtM204V多与rtL180M变异联合出现，rtM204I变异可单独出现。阿德福韦耐药相关变异为rtN236T与rtA181V/T变异，2个位点变异可单独或联合出现。恩替卡韦相关变异是在rtM204V+rtL180M变异基础上，联合rtT184、rtS202或rtM250 3个位点中至少1个位点的氨基酸替代变异。替比夫定常见的耐药相关位点为rtM204I[11]。本研究结果显示，在所检测到耐药基因突变类型中以M204I和M204V/I+L180M两种类型最常见，占50.82%（31/61），这个结果与北京佑安医院的研究结果相同[12]。这两种突变类型是拉米夫定和替比夫定耐药最易发生的类型，说明金华地区慢性乙型肝炎耐药以拉米夫定和替比夫定为主。L180M+M204V+其他的耐药基因突变类型占18.03%（11/61），说明金华地区发生恩替卡韦的耐药率相对较高。因此采用基因测序技术检测HBV P区耐药基因突变对于抗病毒疗效检测和抗病毒方案的制定与调整有重要的意义。

综上所述，本研究对金华地区HBV基因型分布特征和HBV P区耐药基因突变位点类型进行初步探讨，结果发现金华地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型以B、C基因型为主；HBV P区耐药基因位点突变类型多样，以M204I和M204V/I+L180M两种类型最常见；HBV C基因型的患者比B基因型的患者更易发生耐药突变，且更易发生A181V/T位点突变。

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Genotypes and mutation patterns of HBV gene in chronic hepatitis B patients in Jinhua

LIU Ying,ZHU Yijun,WANG Yue. Department of Central Laboratory,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Chronic hepatitis B Resistance mutation Genotype Nucleoside analogues

2017-04-21）

（本文编辑：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-905

321000 金华市中心医院中心实验室

刘颖，E-mail：liuyingtj2008@sina.com

【 Abstract】 Objective To analyze genotypes and mutation patterns of HBVgene in chronic hepatitis B patients in Jinhua. Methods One hundred and four patients with chronic hepatitis B who were treated with nucleoside analogues,were enrolled in the study.Sanger sequence analysis of HBV genotypes and 10 common sites of HBV P region were performed. Results There were 46.15%cases of B genotype and 53.85%of C genotype among 104 chronic hepatitis B patients.Other genotypes were no detected.HBV P gene mutation were detected in 61 cases (58.65%);there was 65.57%in HBV C genotype and 34.43%in B genotype.M204V/I was the most common site of HBV P gene mutation (73.85%),followed by L180M (36.92%)and A181V/T (23.08%).50.82%cases had single site mutation and the most mutation pattern was M204I(29.51%);and 49.18%had multiple sites mutation;the most common mutation patterns were M204I and M204V/I+L180M.The resistance mutation rate in C genotype was higher than that in B genotype(71.43%vs 43.75%,P＜0.05)and the mutation rate of A181V/T in C genotype cases was higher than that in B genotype cases(14.29%vs 2.08%,P＜0.05). Conclusion Genotype B and C are the main genotypes of HBVin this study.The most common mutation patterns of HBVP gene were M204I and M204V/I+L180M.Genotype C patients had more mutations than genotype B and the A181V/T mutation pattern was more common in genotype C.