槐耳清膏联合顺铂改变胃癌SGC7901细胞周期分布的实验研究

谢华夏 徐志远 郑国淀 黄挺 郑国威 滕飞 吕航 程向东

槐耳清膏联合顺铂改变胃癌SGC7901细胞周期分布的实验研究

谢华夏 徐志远 郑国淀 黄挺 郑国威 滕飞 吕航 程向东

目的 观察槐耳清膏联合顺铂（DDP）作用于人胃腺癌SGC7901细胞后细胞周期的变化，并探讨其可能的作用机制。方法 通过细胞流式实验，观察不同浓度槐耳清膏、DDP及两药联合作用于胃癌SGC7901细胞24h后细胞周期的变化情况，并通过Western blot检测不同浓度的槐耳清膏、DDP及两药联合作用于胃癌SGC7901细胞后，细胞周期相关蛋白ATM、H2AX、cdc-2、CyclinB1等的表达情况。结果 细胞流式实验结果显示，槐耳清膏能够阻滞SGC7901细胞于G2/M期，DDP能够阻滞SGC7901细胞于S期，而两药联用后S期和G2/M期都有阻滞。Western blot实验结果显示，槐耳清膏、DDP均可上调p-ATM、γ-H2AX蛋白表达，同时下调CyclinB1蛋白表达，且两药联用后效果更加明显。结论 槐耳清膏、DDP能够通过调节细胞周期相关蛋白的表达改变细胞周期，抑制细胞增殖，与槐耳清膏联用可提高DDP对胃癌的疗效。

胃癌 槐耳 DDP 细胞周期

槐耳清膏是由槐耳菌质经热水抽提后得到的，含有丰富有机成分和10多种矿物质元素，主要活性成是单糖和氨基酸组成的结合蛋白[1]。研究表明其具有抑制肿瘤血管生成[2]、诱导肿瘤细胞凋亡[3]、增加化疗敏感性及逆转耐药的功效[4-5]。笔者团队前期研究发现，槐耳清膏对人胃癌细胞具有抑制生长、诱导凋亡、增加化疗敏感性的作用[4，6]。基于此，本研究将不同浓度的槐耳清膏、顺铂（DDP）及两药联合作用于胃癌细胞SGC7901，观察细胞周期改变，并探计其作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞株SGC7901购自南京凯基生物科技有限公司；FBS、RPMI 1640培养基和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；RNA酶、PI染液购自美国Sig－ma公司；槐耳清膏由启东盖天力药业有限公司提供，配制方法：2g槐耳清膏溶于20ml RPMI1640培养基中，用0.22 μm微孔滤膜过滤后得到100mg/ml储备液，于-20℃长期储存，临用前解冻，用RPMI1640培养基稀释到所需浓度；抗-p-ATM抗体（美国Abcam公司，ab81292，GR27461-26），抗-ATM抗体（美国Abcam公司，ab32420，GR165725-2），抗-γ-H2AX抗体（美国Abcam公司，ab32505，GR106629-16），抗-H2AX抗体（美国Abcam公司，ab31343，GR115423-4），抗-cdc-2抗体（美国Epitomics公司，3787-S，YH120302C），抗-p-cdc-2抗体（美国Epitomics公司，5757-S，YI102703CS），抗-Cyclin B1抗体（美国 Epitomics公司，1495-S，YJ022411P），抗-β-actin抗体（美国Proteintech公司，66009-1-1g，10002260）；CLASS100型细胞培养箱购自美国Thermo公司，流式细胞仪购自美国BD CantoⅡ公司，电泳仪、蛋白印记检测系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SGC7901细胞在含有10%FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中常规培养传代。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期改变 取对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔含2×105个细胞，常规条件下培养24h后去上清液。槐耳组细胞加入含有不同浓度（0、1.5、3mg/ml）槐耳清膏的培养液2ml，DDP组细胞加入含有不同浓度（0、2.5、5μg/ml）DDP的培养液2ml，槐耳+DDP组细胞加入含有不同浓度两药（槐耳清膏0mg/ml+DDP 0μg/ml、槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ ml、槐耳清膏3mg/ml+DDP 5μg/ml）的培养液2ml。各组细胞继续培养24h后，常规消化、离心，收集细胞，制成单细胞悬液；4℃PBS洗2次，用70%冰乙醇4℃固定1h，4℃PBS洗2次，用3ml PBS重悬细胞，加入RNA酶至终浓度为100μg/L，37℃水浴30min，加入PI染液至终浓度为50μg/L，4℃避光 30min，流式细胞仪上机，488nm波长激发检测细胞周期并分析。实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测细胞周期相关蛋白（ATM、H2AX、cdc-2、CyclinB1等）的表达 槐耳组（槐耳清膏1.5mg/ml）、DDP组（DDP 2.5μg/ml）、槐耳+DDP组（槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ml）细胞培养24h后，收集2×106/ml细胞，加入300μl细胞裂解混合液（PMSF：裂解液=1∶99，使PMSF最浓度为1mmol/L），冰上裂解30min，且用BCA方法定量蛋白质。上样前取30～40μg等量蛋白质加上等体积5×上样缓冲液，于100℃变性10min后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电

泳结束后，恒流260mA，90～120min将蛋白质转到PVDF膜上，然后用含5%牛血清白蛋白的TBST室温封闭90min，再进行一抗孵育，将一抗按照抗体说明书推荐比例溶于抗体封闭液中，与对应PVDF膜共同封闭，4℃下过夜。然后，用TBST（TBS＋0.1%Tween 20）于摇床上漂洗膜，10min/次，共4次；再使用对应的二抗孵育，同样按照相应比例稀释（1∶2 000），室温孵育1～ 2h，再用TBST漂洗膜，10min/次，共4次。显色并用Bio-Rad凝胶成像系统采集和分析数据。

1.3 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组SGC7901细胞的细胞周期改变 见表1。

表1 3组SGC7901细胞的细胞周期改变（%）

由表1可见，1.5、3mg/ml浓度的槐耳清膏可阻滞SGC7901细胞周期于G2/M期，G2/M期细胞比例分别为13.22%、30.64%；2.5、5μg/ml浓度的DDP可阻滞SGC7901细胞周期于 S期，S期细胞比例分别为 39.94%、52.78%；槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ml、槐耳清膏3mg/ml+DDP 5μg/ml两药联用可阻滞SGC7901细胞周期于G2/M期、S期，G2/M期细胞比例分别为14.84%、13.64%，S期细胞比例分别为43.54%、56.65%。

2.2 3组SGC7901细胞的细胞周期相关蛋白表达情况 见图1。

由图1可见，槐耳清膏（1.5mg/ml）、DDP（2.5μg/ml）单药及两药联用（槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ml）后，SGC7901细胞p-ATM、γ-H2AX蛋白表达水平均上调，CyclinB1蛋白表达水平下调，两药联用后表达水平变化更明显，而ATM、cdc-2、p-cdc-2蛋白表达水平无明显变化。

图1 3组SGC7901细胞的细胞周期相关蛋白表达电泳图

3 讨论

近年来，中药因其独特的低毒、抗肿瘤功效，在临床上已广泛用于治疗肿瘤。槐耳清膏作为槐耳真菌的热水提取物，已被证实具有抑制肿瘤细胞生长、转移及提高人体免疫力的功效。研究发现，槐耳清膏对肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤的生长、转移有抑制作用，笔者团队在前期研究中也发现槐耳清膏能够通过诱导胃癌细胞MKN45、SGC7901凋亡抑制其细胞增殖的效应，并且能够增加DDP对胃癌细胞MKN45的化疗敏感性。通过细胞流式实验发现槐耳清膏单药能改变人胃癌SGC7901细胞的细胞周期分布情况，阻滞细胞周期于G2/M期，而槐耳清膏联合DDP共同作用时，在增加G2/ M期阻滞的同时，还能够显著增加DDP对S期的阻滞效应；进一步通过Western blot实验发现槐耳清膏能够调节细胞周期相关蛋白，与DDP联合作用能够促进对DDP对周期相关蛋白的调节。

恶性肿瘤最基本的生物学特征是肿瘤细胞失控性增殖，而细胞失控性增殖的生物学基础是细胞周期调控紊乱[7]。本研究结果显示，槐耳清膏、DDP单药作用于SGC7901细胞后，能够分别阻滞细胞周期于G2/M期、S期，而G2/M期DNA损伤检验点是细胞周期至有丝分裂前细胞自我修复的最后阶段[8]。进一步Western blot实验，结果显示槐耳清膏、DDP单药及两药联用能够上调SGC7901细胞γ-H2AX、p-ATM蛋白的表达，而γ-H2AX是判断早期DNA双键断裂的金标准[8]。由此可见，槐耳清膏和DDP是通过诱发DNA双键断裂来改变细胞周期的，进而诱导细胞凋亡，两药共同作用后表现出联合效应。

细胞周期中如果出现DNA损伤，将激活ATM和Rad-3相关蛋白（ART）激酶，并将DNA损伤信号传导到下游靶蛋白，启动应激系统，产生细胞周期阻滞，为DNA修复或启动细胞凋亡程序提供时间[9-10]。本研究中经槐耳清膏、DDP单药和两药联用后的SGC7901细胞的ATM基因被激活，即p-ATM的表达增加。这说明槐耳清膏、DDP都诱发了DNA的损伤，进而出现细胞周期被阻滞于G2期，且两药联合作用后，对ATM的激活效应增加。

此外，本研究结果还发现槐耳清膏、DDP均能下调CyclinB1蛋白表达水平，两药联用后效应更加明显。CDK1-CyclinB1复合物已被证实是细胞由G2期进入M期的关键调节蛋白[10]，CDK1-CyclinB1复合物合成减少引起了细胞周期阻滞于G2期，这也可能是槐耳清膏诱导SGC7901细胞凋亡又一个作用机制，同时说明了槐耳清膏、DDP对DNA的损伤作用可能发生在G2/M期。

综上所述，槐耳清膏通过诱发DNA损伤，激活ATM细胞信号通路，诱导人胃癌SGC7901细胞的细胞周期阻滞于G2/M期，而DDP阻滞SGC7901细胞的细胞周期于S期，两者共同作用可提高胃癌SGC7901细胞对DDP的化疗敏感性，即与槐耳清膏联用可能提高DDP对胃癌的疗效。

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Combined effects of fungi Huaier extracts and cis-platin on cell cycle of human gastric cancer cell line SGC7901

XIE Huaxia，XU Zhiyuan，ZHENG Guodian,et al.Department of General Surgery,The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310018,China

Gastric cancer Huaier DDP Cell cycle

2016-03-28）

（本文编辑：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2016-2035

浙江省重大科技专项计划项目（2013C03044-4）

310018 杭州，浙江中医药大学附属第一医院下沙院区普外科（谢华夏）；浙江中医药大学附属第一医院湖滨院区胃肠外科（徐志远、程向东），中心实验室（吕航）；浙江中医药大学第一临床医学院（郑国淀、黄挺、郑国威、滕飞）

程向东，E-mail：chengxd@126.com

【 Abstract】 Objective To investigate the combined effects of fungi Trametes robiniophila murr(Huaier)extracts and cis-platin(DDP)on cell cycle of gastric cancer cell line SGC7901in vitro and the underline mechanism. Methods Human gastric cancer SGC7901 cells were treated with Huaier and/or DDP in vitro.The cell cycle was examined by flow cytometry;and the expression of cell cycle-related proteins was detected by Western blot. Results The ratio of cells in G2/M phase of SGC7901 cells treated with Huaier were increased in a dose-dependent manner compared with control group;and the ratio of cells in S phase in DDP-treated groups were increased also in a dose-dependent manner.The cells arrested at G2/M and S phases were markedly increased in Huaier and DDP combined treatment groups.The expression of CyclinB1 was down-regulated and expression of p-ATM，γ-H2AX was up-regulated in Huaier and/or DDP treatment groups. Conclusion Huaier and DDP can change cell cycle through up-regulation of p-ATM,γ-H2AXexpression and down-regulation of CyclineB1 expression in human gastric cancer SGC7901 cells.