手足口病患者病原学快速诊断方法的比较研究

沈伟锋 邵平扬 殷新光 姚明 邹洪兴 杨清萍

手足口病患者病原学快速诊断方法的比较研究

沈伟锋 邵平扬 殷新光 姚明 邹洪兴 杨清萍

目的 比较荧光RT-PCR法与胶体金免疫层析法（GICA）在手足口病（HFMD）患儿病原学快速诊断中的应用价值，为实验室诊断提供参考。方法 选取HFMD患儿454例（其中重症患儿190例，普通患儿264例）以及非肠道病毒感染、健康体检儿童共117例。同时采集患儿急性期咽拭子和血清标本各1份，分别进行肠道病毒EV通用型、EV71型和CA16型病毒核酸以及血清EV71-IgM、CA16-IgM抗体检测。比较两种方法对EV71、CA16的检测结果；并以RT-PCR法为金标准，对GICA法检测的诊断性能进行评价。结果 荧光RT-PCR法检测重症HFMD组EV71阳性率72.6%（138/190），CA16阳性率10.0%（19/190）；普通HFMD组EV71阳性率28.0%（74/264），CA16阳性率30.3%（80/264），两组HFMD肠道病毒感染分布构成比差异有统计学意义（χ2=88.66，P=0.00）。454例HFMD患儿中，RT-PCR法与GICA法检测EV71型，阳性率分别为46.7%和58.6%，差异有统计学意义（χ2=39.01，P=0.00）；RT-PCR法与GICA法检测CA16型，阳性率分别为21.8%和30.0%，差异有统计学意义（χ2=22.74，P=0.00）。以RT-PCR法法为金标准，GICA法诊断EV71的灵敏度95.7%，特异度84.4%，阳性预测值76.3%，阴性预测值95.2%，准确度84.1%；诊断CA16的灵敏度89.9%，特异度86.7%，阳性预测值65.4%，阴性预测值96.8%，准确度87.4%。结论 GICA法是一种简便、灵敏的检测方法，可用于HFMD病原体的快速筛查，与RT-PCR法具有较好的互补性；两种方法联合检测对HFMD的早期诊断与防控具有十分重要的意义。

手足口病 肠道病毒属 核酸 抗体 诊断

手足口病（HFMD）是由肠道病毒引起的儿童传染病，多发于5岁以下儿童。引起HFMD的肠道病毒种类多，目前以肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）为最主要流行毒株，对HFMD病原体快速检测及分型有利于HFMD的早期诊断和治疗，也是危重病例救治的关键[1-2]。目前，HFMD病原体的实验诊断方法以实时荧光RT-PCR病毒核酸检测与肠道病毒特异性IgM抗体检测应用最为普遍[3]。实时荧光RT-PCR法因具有较高的灵敏度和检测效率，已成为HFMD病原学分型诊断的金标准，但受实验室条件限制，仅在大中型医疗机构开展。HFMD病例一般为散在的急症患儿，往往伴有发热症状，病情比较紧急，需要早期快速检测确认。胶体金免疫层析（GICA）法是目前应用最为广泛的EV71-IgM、CA16-IgM即时筛查方法，其检测过程仅需几分钟，特别适合在基层医疗机构开展[4]。为探讨HFMD病原学快速诊断方法的临床应用价值，笔者分别采用RT-PCR法和GICA法分别对HFMD患儿进行肠道病毒核酸检测及特异性IgM抗体检测，对两种方法进行比较分析，为临床快速甄别HFMD病原体及早期诊断提供参考，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年3至11月嘉兴市第一医院感染科就诊的HFMD患儿454例，其中男235例，女219例；年龄6个月～5岁6个月，中位年龄20个月，HFMD临床诊断标准依据卫生部颁布的《手足口病诊疗指南》（2010年版）[5]。纳入标准：（1）临床症状表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹，伴或不伴发热；（2）病程1～5d初次就诊，未经抗病毒治疗的急性期患儿；（3）肠道病毒通用型（EV）核酸检测阳性；（4）重症患儿出现神经系统受累症状，表现为精神差、嗜睡、易惊、头痛、呕吐、谵妄、昏迷、肢体抖动、肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍、无力或急性弛缓性麻痹、惊厥等，体格检查可见脑膜刺激征、腱反射减弱或消失、巴宾斯征等病理征阳性[5]。根据临床表现将454例HFMD患儿分为重症HFMD组190例和普通HFMD组264例。同期选取嘉兴市第一医院儿科就诊或体检儿童117例作为非肠道病毒感染对照组，均经直接免疫荧光法和荧光RT-PCR法鉴定为非肠道病毒感染，其中呼吸道合胞病毒阳性17例、轮状病毒阳性13例、腺病毒感染阳性9例、EB病毒阳性27例、巨细胞病毒阳性31例，以及健康体检儿童20例。HFMD组和对照组性别、年龄、体重差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表1。

表1 HFMD组和对照组性别、年龄、体重的比较

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理 每例患儿均留取急性期咽拭子样本1份，用病毒专用采样管采集，-70℃低温保存，用于肠道病毒核酸检测。同时采集患儿静脉血2ml于EDTA-K2抗凝管,标本离心后随即进行GICA检测肠道病毒EV71-IgM和CA16-IgM抗体。

1.2.2 肠道病毒核酸检测 病毒RNA提取试剂QLAamp Viral RNA Mini Kit购自德国Qiagen公司；使用一步法实时荧光RT-PCR试剂盒肠道病毒EV通用型、EV71型、CA16型病毒RNA，试剂盒购置广州中山大学达安基因股份有限公司,使用美国ABI7500荧光PCR仪进行核酸扩增，PCR扩增反应条件为：50℃20minRNA逆转录；95℃15min预变性；94℃15s变性，56℃45s退火，扩增40个循环。RNA核酸提取及结果分析按说明书进行操作。

1.2.3 EV71-IgM和CA16-IgM抗体检测 采用GICA即时检测急性期HFMD患儿以及临床诊断非HFMD患儿血清EV71-IgM和CA16-IgM抗体。GICA法EV71-IgM、CA16-IgM抗体检测板购自北京万泰生物药业有限公司，严格根据试剂盒说明书操作，在规定时间内进行目测并判断结果，不论色带颜色深浅均按阳性记录。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；两组独立样本间比较采用t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。以RT-PCR法为诊断金标准，对GICA法进行诊断性能评价，统计指标包括灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测EV71和CA16病毒核酸结果 454例HFMD患儿中，共检出EV71（+）212例（46.7%）, CA16（+）99例（21.8%），EV71（-）CA16（-）143例（31.5%）。重症HFMD组与普通HFMD组肠道病毒检出结果见表2，两组患儿肠道病毒检出构成比差异有统计学意义（χ2=88.66，P=0.00）。

表2 重症HFMD与普通HFMD患者肠道病毒核酸检测结果[例（%）]

2.2 RT-PCR与GICA法检测EV71结果比较 RTPCR法与GICA法检测454例HFMD患者EV71阳性率分为46.7%和58.6%，两者阳性率比较差异有统计学意义（χ2=39.01,P=0.00），详见表3。

表3 RT-PCR与GICA法检测EV71结果比较[例（%）]

2.3 RT-PCR与GICA法检测CA16结果比较 RTPCR法与GICA法检测454例HFMD患者CA16阳性率分为21.8%和30.0%，两者阳性率比较差异有统计学意义（χ2=22.74，P=0.00），详见表4。

表4 RT-PCR与GICA法检测CA16结果比较[例（%）]

2.4 GICA法检测非肠通病毒感染患儿血清EV71-IgM和CA16-IgM抗体结果 对97例非肠道病毒感染患儿血清EV71-IgM和CA16-IgM抗体结果检测，共检出EV71-IgM抗体阳性3例，CA16-IgM抗体阳性1例。对上述4例GICA法检测EV71-IgM和CA16-IgM抗体阳性患儿重新采集咽拭子，进行肠道病毒EV、EV71、CA16核酸RNA确认，均为病毒核酸阴性；采用ELISA法进行特异性抗体EV71-IgM和CA16-IgM检测，2例患儿EV71-IgM仍为阳性，但追踪检测，EV71-IgM抗体滴度未升高。20例健康体检儿童GICA法未检出EV71-IgM和CA16-IgM阳性结果。

2.5 GICA法诊断HFMD性能评价 以RT-PCR法为金标准，GICA法检测HFMD患者EV71的灵敏度95.7%，特异度84.4%，阳性预测值76.3%，阴性预测值95.2%,准确度84.1%。GICA法检测HFMD患者CA16的灵敏度89.9%，特异度86.7%，阳性预测值65.4%，阴性预测值96.8%,准确度87.4%，见表5～6。

表5 RT-PCR法与GICA法检测HFMD患儿EV71的结果（例）

表6 RT-PCR法与GICA法检测HFMD患儿CA16的结果（例）

3 讨论

HFMD已成为儿童常发生的传染病之一，每年5～7月份是高发期，5岁以下儿童是主要患儿[1]。2015年12月，国家食品药品监督管理总局批准了首个肠道病毒71型灭活疫苗的生产注册申请，并于2016年3月18日正式上市[6]，临床试验显示，EV71疫苗对EV71感染HFMD的保护效力在90%以上，但受样本数量限制，对EV71感染所致重症病例的保护效力以及免疫的持久性等缺乏准确评估，对CA16感染和其他肠道病毒感染的HFMD无保护作用[6-8]。因此，HFMD疫情的防控任务依然严峻。

由于HFMD早期症状不典型，临床诊断易与咽峡炎等其他感染性疾病相混淆，临床误诊、漏诊现象较为多见，因此HFMD的早期快速确诊以及EV71型与CA16型等肠道病毒鉴别仍需通过实验室病原学的检测确认。目前，HFMD实验室病原学确诊主要依据[5]：（1）肠道病毒特异性核酸检测阳性；（2）分离出肠道病毒，并鉴定为EV71、CA16或其他可引起HFMD的肠道病毒；（3）急性期与恢复期双份血清EV71、CA16或其他可引起HFMD的肠道病毒抗体4倍以上升高。因病毒分离法与双份血清抗体检测法临床早期诊断应用的局限性，且RT-PCR检测病毒核酸其灵敏度和检测效率较细胞培养法双份血清抗体检测法存在明显优势，已成为HFMD病原学诊断及分型的金标准。但核酸检测技术受实验室条件限制，不易在基层医疗机构开展。GICA法可即时检测急性期患儿血清EV71-IgM、CA16-IgM，检测耗时仅需几分钟，已成为HFMD早期病原学快速检测的筛查方法。

本研究中，对454例HFMD急性期咽拭子标本进行荧光RT-PCR法检测肠道病毒核酸检测，EV71型、CA16型和非EV71非CA16的肠道病毒在HFMD重症病例中所占比例分别是72.6%，10.0%和17.4%；在HFMD普通患儿中所占比例分别是28.0%，30.3%和41.7%。可见EV71型肠道病毒在HFMD重症病例中占主导优势，结果与文献报道基本一致[9-10]；同时非EV71非CA16型肠道病毒在HFMD患病原体中也占有一定比例，临床亦不可忽视非EV71非CA16的其他肠道病毒在HFMD患儿，特别是重症患儿中的检出情况。荧光RT-PCR方法可同时检测肠道病毒通用型、EV71型和CA16型，因此可区分EV71、CA16和非EV71非CA16肠道病毒，为临床快速甄别HFMD病原体提供及时、可靠的实验依据。

目前，GICA法检测EV71-IgM、CA16-IgM抗体已在临床普遍使用，检测时间短，特别适合在基层医疗机构以及急症患者HFMD病原体的早期诊断。有文献报道，EV71-IgM、CA16-IgM特异性抗体在患儿发病首日即可检出，病程第5～8天达到峰值[2]，因此EV71-IgM、CA16-IgM抗体检测可用于HFMD的早期实验室诊断。本研究对RT-PCR法与GICA法检测454例HFMD急性期标本结果进行比较，两种方法对EV71型、CA16型肠道病毒的阳性检出率有统计学差异，GICA法对EV71型、CA16型肠道病毒的阳性检出率明显高于RT-PCR法。对97例非肠道病毒感染患儿血清EV71-IgM和CA16-IgM抗体结果检测，共检出EV71-IgM抗体阳性3例，CA16-IgM抗体阳性1例，经RT-PCR法检测肠道病毒EV、EV71、CA16核酸RNA确认，均为病毒核酸阴性；双份标本特异性抗体滴度确认也排除HFMD可能，考虑是非特异性干扰引起的假阳性结果。以RT-PCR法作为金标准，对GICA法进行方法性能评价，GICA法检测EV71-IgM的灵敏度95.7%，特异度84.4%，阳性预测值76.3%，阴性预测值95.2%,准确度84.1%；GICA法检测CA16-IgM的灵敏度89.9%，特异度86.7%，阳性预测值65.4%，阴性预测值96.8%,准确度87.4%。结果显示，GICA法具有很高的灵敏度和阴性预测值，比较适用于HFMD病原体的早期筛查。但由于其阳性预测值较低，提示方法存在较高的假阳性率，对阳性结果有必要作进一步病原学的核酸确诊；其次，GICA方法目前只能对EV71-IgM和CA16-IgM等少数肠道病毒特异性抗体进行筛查，因此无法对非EV71非CA16型肠道病毒进行鉴别，易造成临床对非EV71非CA16型肠道病毒感染HFMD患儿的漏诊，因此临床对可疑HFMD患儿，特别是重症患儿，需进一步采用RT-PCR方法进行肠道病毒通用型核酸检测，以明确诊断。

因GICA法具有较高的检测假阳性率，而RT-PCR法亦可能存在一定的假阴性率，对临床诊断疑似HFMD，而肠道病毒通用型EV核酸检测阴性的患者，临床诊断及GICA筛查结果具有一定的不确定性，本研究未将这类患儿纳入研究。临床实际工作中，对GICA法检测EV71-IgM和CA16-IgM结果阳性而RT-PCR法核酸阴性患儿，建议进行RT-PCR复查，必要时重新留取咽拭子标本，以避免因核酸提取或标本污染造成RTPCR结果的假阴性影响。

综上所述，RT-PCR法可区分EV71、CA16和非EV71非CA16肠道病毒感染HFMD，对HFMD肠道病毒病原体检测实现全覆盖，但受实验室条件限制，基层医院不易开展；GICA法是一种简便、敏感的检测方法，具有较高的阴性预测值，可用于HFMD病原体的快速筛查。两种方法在HFMD病原学早期诊断中具有重要的实验室诊断价值。

[1] 覃秋琴,金玉.手足口病的相关研究进展[J].中华传染病杂志,2015, 33(9):575-576.doi:10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2015.09. 019.

[2] Xu F,Yan Q,Wang H,et al.Performance of detecting IgM antibodies against enterovirus 71 for early diagnosis[J].PLoS One, 2010,5(6):e11388.doi:10.1371/journal.pone.0011388

[3] 李斌,欧维琳.手足口病病原学及检测方法研究进展[J].中华实用儿科临床杂志,2016,31(6):477-480.doi:10.3760/cma.j.issn. 2095-428X.2016.06.021.

[4] Zhang A,Zhang M,Zhang H,et al.Development of a dot-immunoenzyme filtration assay for the detection of enterovirus 71 antigen in human serum via immunoglobulin M[J].J Int Med Res. 2012,40(3):1122-1129.doi:10.1177/147323001204000332.

[5] 中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南 (2010年版)[J].国际呼吸杂志,2010,30(24):1473-1475.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-436X.2010.024.001.

[6] 高雪.肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗研究进展[J].国际生物制品学杂志,2016,39(4):171-175.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4211. 2016.04.004.

[7] Mao Q,Wang Y,Shao J,et al.The compatibility of inactivated-Enterovirus 71 vaccination with Coxsackievirus A16 and Poliovirus immunizations in humans and animals[J].Hum Vaccin Immunother,2015,11(11):2723-2733.doi:10.1080/21645515.2015. 1011975.

[8] Aswathyraj S,Arunkumar G,Alidjinou E K,et al.Hand,foot and mouth disease(HFMD):emerging epidemiology and the need for a vaccine strategy[J].Med Microbiol Immunol,2016,205(5): 397-407.doi:10.1007/s00430-016-0465-y

[9] 顾红岩,刘志达,张玲,等.2013年北京地区手足口病住院患儿的病原分布及临床特点 [J].中华儿科杂志,2015,53(6):459-463.doi: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2015.06.012.

[10] 罗伟滨,汪国庆,肖奇志,等.248例手足口病病原体检测结果分析[J].检验医学与临床,2016,13(Z1)202-203.doi:10.3969/j.issn. 1672-9455.2016.25.088.

Comparison of GICA to RT-PCR in rapid pathogenic diagnosis of hand,foot and mouth disease

SHEN Weifeng，SHAO Pingyang，YING Xinguang，et al.Clinical Laboratory,Jiaxing First Municipal Hospital,Jiaxing 314000,China

Hand,foot and mouth disease Enterovirus Nucleic acid Antibody Diagnosis

2017-03-24）

（本文编辑：严玮雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-624

浙江省科技厅公益技术应用研究计划项目（2015C33279）；嘉兴市科技计划项目（2013AY21042-7）

314001 嘉兴市第一医院检验科（沈伟锋、邵平扬、姚明、邹洪兴、杨清萍）；嘉兴市妇幼保健院消化科（殷新光）

沈伟锋，E-mail：jxshwf@qq.com

【 Abstract】 Objective To compare the application of colloidal gold immunochromatography assay(GICA)to fluorescence RT-PCR in rapid pathogenic diagnosis of hand,foot and mouth disease(HFMD). Methods Four hundred and fifty four children with HFMD diagnosed in our hospital from March to November 2016 were enrolled,including 190 severe cases and 264 mild case;and 117 healthy children served as controls.The throat swabs and serum samples were collected.The nucleic acids of enterovirus,enterovirus type 71(EV71),Coxsackievirus A16(CA16)were determined by RT-PCR and GICA,the serum antibody tests for EV71-IgM and CA16-IgM were also performed．The test results of EV71 and CA16 by using two methods were compared;and RT-PCR was taken as gold standard to evaluate the diagnostic capacity of GICA. Results The positive rates of EV71 and CA16 by RT-PCR method in severe patients were 72.6%(138/190)and 10.0% (19/190),in mild patients were 28% (74/264)and 30.3%(80/264),respectively(χ2=88.66,P=0.01).The positive rates of EV71 in all 454 cases by RT-PCR and GICA were 46.7%and 58.6%,respectively(χ2=39.01,P=0.01),the positive rates of CA16 by RT-PCR and GICA were 21.8%and 30.0%, respectively(χ2=22.74,P=0.01).With RT-PCR results as gold standard,the sensitivity,specificity,positive predictive value, negative predictive value and the accuracy of GICA in detection of EV71 were 95.7%,84.4%,76.3%,95.2%and 84.1%,those for CA16 were 89.9%,86.7%65.4%,96.8%and 87.4%,respectively. Conclusion GICA is a simple,sensitive method in rapid screening pathogens of hand,foot and mouth disease,which can be used as a complementary method to RT-PCR.