青蒿琥酯诱导胃癌BGC-823细胞死亡的实验研究

王维明 周香 郑志强

●论 著

青蒿琥酯诱导胃癌BGC-823细胞死亡的实验研究

王维明 周香 郑志强

目的 观察青蒿琥酯（ART）对胃癌细胞株BGC-823的裸鼠移植瘤生长的影响，并探讨其可能的作用机制。方法将胃癌BGC-823细胞注射至裸鼠右侧背部近腋下部位皮下，建立荷瘤裸鼠模型并随机分为空白对照组（0mg/kg ART组）、60mg/kg ART组、120mg/kg ART组、240mg/kg ART组，每组5只。各组裸鼠每天腹腔注射ART1次（空白对照组注射0.9%氯化钠溶液），连续15d，观察裸鼠移植瘤生长情况，并采用RT-PCR、免疫组化及Western blot法测定血管内皮生长因子（VEGF）及钙中性蛋白酶2（Calpain2）表达情况。结果 4组裸鼠移植瘤体积比较有统计学差异（P＜0.05），两两比较亦有统计学差异（均P＜0.05），与空白对照组比较，60mg/kg ART组、120mg/kg ART组、240mg/kg ART组裸鼠移植瘤体积均明显缩小，ART表现出剂量依赖性的抑瘤作用。4组胃癌BGC-823细胞VEGF、Calpain2 mRNA与蛋白表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05），两两比较亦有统计学差异（均P＜0.05），与空白对照组比较，60 mg/kg ART组、120 mg/kg ART组、240 mg/kg ART组细胞VEGF mRNA与蛋白相对表达水平均下降，Calpain2 mRNA与蛋白相对表达水平均升高，且VEGF相对表达水平随ART浓度升高而降低，而Calpain2相对表达水平随ART浓度升高而升高。结论 ART在胃癌移植瘤模型体内起剂量依赖性的抑瘤作用，该作用机制可能与下调VEGF的表达、上调Calpain2的表达有关。

青蒿琥酯 胃癌 裸鼠模型

青蒿琥酯（ART）是青蒿素衍生物，即二氢青蒿素-10-α-丁二酸单酯，分子式C19H28O8，有较好的水溶性，是具有过氧化桥的倍半萜类化合物。研究表明，ART具有抗肿瘤作用，且具有低毒性、不存在交叉耐药等优势[1-2]。细胞胀亡是指以细胞肿胀为突出特征的细胞死亡，其形态表现与凋亡不同[3]。笔者团队前期研究发现，ART体外作用于胃癌BGC-823细胞后，细胞出现肿胀、溶解性死亡，呈典型的细胞胀亡特征[4-5]。基于此，本研究进一步通过体内实验探讨ART诱导胃癌细胞死亡的作用机制，以期为临床胃癌的治疗提供参考，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞株BGC-823由上海生命科学研究所提供；20只无胸腺的BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。ART注射液（广西桂林南药制药厂，国药准字H10930195，批号LA100703）；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM购自日本Takara公司；兔抗人血管内皮生长因子（VEGF）及钙中性蛋白酶2（Calpain2）多克隆抗体购自英国abcam公司；即用型免疫组化二抗试剂盒及DAB、苏木素复染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 癌细胞的培养及实验模型的建立 胃癌BGC-823细胞培养于完全RPMI-1640培养液（含10%FBS、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素）中，置于37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养。用胰蛋白酶消化对数生长期BGC-823细胞，用含10%FBS的1640培养基终止消化。离心后将细胞用不含血清的1640培养基洗涤1次，再次离心将细胞混匀于不含血清的1640培养基中。将BGC-823细胞悬浮，用一次性注射器注射至裸鼠右侧背部近腋下部位皮下，每只注射约1×107个细胞。1周后，所有裸鼠的移植瘤体积约200mm3，成瘤率100%。实验过程遵循浙江省有关实验动物保护与使用的准则。

1.2.2 具体给药情况及观察指标 根据移植瘤体积大小排序，将荷瘤裸鼠按随机数字表法分为4组：空白对照组（0mg/kg ART组）、60mg/kg ART组、120mg/kg ART组、240mg/kg ART组，每组5只。分组后第2天开始给药，各组每天腹腔注射ART 1次（空白对照组注射0.9%氯化钠溶液）。每次均在注射药物前测量体重，并根据体重进行给药，连续给药15d。移植瘤体积=（荷瘤裸鼠的长径×短径2）/2。每隔3d测量移植瘤体积大小1次，观察裸鼠活跃性，记录结果并计算各组抑瘤率 [抑瘤率＝（空白对照组移植瘤平均体积－实验组组移植瘤平均体积）/空白对照组移植瘤平均体积×100%]。

1.2.3 RT-PCR检测VEGF、Calpain2 mRNA表达 分组同上，Trizol法提取总RNA。取500 ng的RNA，按试剂盒DRR037A说明书逆转录合成cDNA。引物探针由上海基康生物技术有限公司设计并合成。VEGF上游引物5′-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3′，下游引物5′-CA－TTTGTTGTGCTGTAGGAAGCT-3′。Calpain2上游引物5′-GAAGGGTGGAGCCAGGTAGA-3′；下游引物：5′-GGGAAAGCCGCTGTTGTT-3′。内参基因ACTB上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3′。荧光定量PCR反应体系及条件参照SYBR Premix Ex TaqTM说明书。数据采用LightCycler 480软件分析，以各组VEGF、Calpain2 mRNA与ACTB的相对表达水平作为衡量基因半定量表达的结果。

1.2.4 免疫组化法检测VEGF、Calpain2蛋白定性表达 取空白对照组及120 mg/kg ART组标本置于4%多聚甲醛中固定，包埋切片。石蜡切片脱蜡去水；3%双氧水室温孵育5～10min以灭活内源性过氧化物酶；加0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），于微波炉内修复10 min；滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min，滴加一抗工作液（1∶100稀释），4℃过夜；PBS冲洗，5 min×3次，滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS冲洗，5 min×3次；滴加生物素山羊抗兔IgG，37℃孵育15 min；PBS冲洗，5min×3次；显色剂显色3 min（DAB）；自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片；以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性结果。

1.2.5 Western blot法检测VEGF、Calpain2蛋白定量表达 提取4组标本总蛋白，并计算出上样体积。变性后SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜，然后加入VEGF及Calpain2一抗（1∶500）4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化酶标记的IgG二抗（1∶6 000）室温孵育2 h，应用超敏ECL化学发光试剂盒曝光，以Tubulin蛋白作为内参照。采用Image Tool凝胶图像分析系统进行分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸鼠移植瘤生长情况比较 腹腔内用药15 d后，各组裸鼠体重、移植瘤体积比较见图1、2。

图1 各组裸鼠体重比较

由图1可见，各组裸鼠体重比较差异无统计学意义（P＞0.05），裸鼠体重也未见明显变化，即ART未表现出明显的毒副反应。由图2可见，各组裸鼠移植瘤体积比较有统计学差异（P＜0.05），两两比较亦有统计学差异（均P＜0.05），与空白对照组比较，60 mg/kg ART组、120 mg/kg ART组、240 mg/kg ART组裸鼠移植瘤体积均明显缩小，抑瘤率分别约为37.2%、45.0%、58.1%，即ART表现出剂量依赖性的抑瘤作用。

图2 各组裸鼠移植瘤体积比较

2.2 各组胃癌BGC-823细胞VEGF、Calpain2 mRNA表达水平比较 见表1。

由表1可见，4组胃癌BGC-823细胞VEGF、Calpain2 mRNA表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05），两两比较亦有统计学差异（均P＜0.05），与空白对照组比较，60 mg/kg ART组、120 mg/kg ART组、240 mg/kg ART组细胞VEGF mRNA相对表达水平均明显下降，Calpain2 mRNA相对表达水平均升高，即VEGF mRNA相对表达水平随ART药物浓度升高而降低，而Calpain2 mRNA相对表达水平随ART药物浓度升高而升高。

表1 各组胃癌BGC-823细胞VEGF、Calpain2 mRNA表达水平比较

2.3 各组胃癌BGC-823细胞VEGF、Calpain2蛋白表达情况比较 见图3-5。

图3 各组胃癌BGC-823细胞VEGF蛋白表达情况比较（a：120mg/kg ART组；b：空白对照组；苏木素染色，×200）

图4 各组胃癌BGC-823细胞Calpain2蛋白表达情况比较（a：120mg/kg ART组；b：空白对照组；苏木素染色，×200）

图5 各组胃癌BGC-823细胞VEGF、Calpain2蛋白表达情况比较（a:空白对照组；b:60 mg/kg ART组；c:120 mg/kg ART组；d:240 mg/kg ART组）

由图3、4可见，VEGF、Calpain2蛋白均表达于细胞质。由图5可见，4组胃癌BGC-823细胞VEGF、Calpain2蛋白表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05），两两比较亦有统计学差异（均P＜0.05），与空白对照组比较，60 mg/kg ART组、120 mg/kg ART组、240 mg/kg ART组细胞VEGF蛋白相对表达水平（分别为0.78±0.02、0.62±0.01、0.29±0.01）均下降，Calpain2蛋白相对表达水平（分别为1.14±0.02、2.46±0.03、3.98±0.04）均升高，即VEGF蛋白相对表达水平随ART药物浓度升高而降低，而Calpain2蛋白相对表达水平随ART药物浓度升高而升高。

3 讨论

Majno及Joris最早在同一细胞损伤中发现两种不同的细胞形态学改变，细胞溶解与细胞肿胀，并将这两种不同的死亡形态分别命名为凋亡与胀亡[6]。凋亡作为细胞死亡的方式已被广泛接受，是迄今为止研究最深入的细胞死亡方式；而细胞胀亡在肿瘤的发生、发展中也占有重要地位。周晋等[7]报道青蒿素能使人白血病细胞株NB4、K562和原代APL细胞发生胀亡，Du等[8]报道ART能通过活性氧损伤机制诱导胰腺癌细胞发生胀亡。笔者团队经前期实验发现ART可在体外诱导胃癌细胞发生胀亡[4-5]。本实验研究在前期成果的基础上，发现ART在胃癌移植瘤模型体内产生了剂量依赖性的抑瘤作用，60 mg/kg ART组、120 mg/kg ART组、240 mg/kg ART组裸鼠移植瘤体积均缩小，抑瘤率分别约为37.2%、45.0%、58.1%，且裸鼠未出现明显的毒副反应。可见，ART有潜力发展成为一种通过细胞胀亡机制抑制胃癌细胞增殖的候选药物，可以增强胃癌细胞的化疗敏感性。

接着，本研究进一步通过分子生物学技术研究其可能作用机制。研究表明，细胞在缺氧的环境下，能量耗竭导致离子失衡（特别是钙离子），激活钙相关蛋白诱导细胞胀亡[9-10]。Calpain是一种钙依赖性的中性蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族，能水解spectrin、paxillin及vinculin肌纤维蛋白，与细胞胀亡的发生密切相关[11]。Calpain抑制剂能够抑制细胞发生胀亡，对细胞凋亡没有抑制作用或抑制作用较弱。Calpain活性受细胞中钙离子的浓度影响，钙离子可以激活此蛋白，根据激活此种蛋白所需的钙离子浓度，Calpain分为Calpain1（微摩尔级）和Calpain2（毫摩尔级）。Calpain1能在正常生理条件下发挥功能，而Calpain2则在病理条件下(如细胞内钙超载)才能激活，引起细胞膜通透性增加进而使细胞发生胀亡[10]。笔者推测ART可能是通过诱导细胞缺氧，VEGF下降导致钙离子超载，激活了Calpain2蛋白，从而诱导细胞发生胀亡。

为验证这一假设，本研究通过RT-PCR、免疫组化及Western blot法检测胃癌BGC-823细胞中VEGF、Calpain2的变化，结果显示经ART作用后，VEGF的mRNA及蛋白相对表达水平随药物浓度升高而降低，而Calpain2的mRNA及蛋白相对表达水平则随药物浓度升高而升高。由此可知，ART抑制胃癌细胞的增殖、诱导其胀亡与VEGF表达下调及Calpain2表达上调有关。

综上所述，ART在胃癌移植瘤模型体内通过细胞胀亡起剂量依赖性的抑瘤作用，该作用机制可能与下调VEGF的表达、上调Calpain2的表达有关。ART或可成为胃癌化疗候选药物，具有重要临床价值。

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（本文编辑：李媚）

读者·作者·编者

《浙江医学》对医学论文中有关实验动物描述的要求

在医学论文的描述中，凡涉及实验动物者，在描述中应符合以下要求：（1）品种、品系描述清楚；（2）强调来源；（3）遗传背景；（4）微生物学质量；（5）明确等级；（6）明确饲养环境和实验环境；（7）明确性别；（8）有无质量合格证；（9）有对饲养的描述（如饲料型、营养水平、照明方式、温度、温度要求）；（10）所有动物数量准确；（11）详细描述动物的健康状况；（12）对动物实验的处理方式有单独清楚的交代；（13）全部有对照，部分可采用双因素方差分析。

本刊编辑部

Effects of artesunate on transplanted human gastric cancer BGC-823 in nude mice

WANG Weiming,ZHOU Xiang,ZHENG Zhiqiang. Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Artesunate Stomach neoplasms Nude mice model

2017-04-11）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-802

温州市科技计划项目（Y20140105、Y20140111）

325000 温州医科大学附属第一医院肝胆外科(王维明）；温州医科大学附属第二医院肿瘤外科（周香、郑志强）

王维明，E-mail：wwm_boy2010@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of artesunate on transplanted human gastric cancer in nude mice. Methods Human gastric cancer BGC-823 cells were inoculated in nude mice.The tumor-bearing nude mice were treated with artesunate at a dose of 60,120,or 240 mg/(kg·d),i.p.for 15 d.The changes of body weights and tumor size were observed.The expression of VEGF and Calpain2 mRNA and proteins were detected by RT-PCR,immunohistochemical and Western Blot, respectively. Results Artesunate suppressed BGC-823 tumor growth in nude mice in a dose-dependent manner.The expression of VEGF mRNA and protein were decreased and the expression of Calpain2 mRNA and protein were increased in cancer cells of artesunate-treated nude mice,compared to control group (P＜0.05). Conclusion Artesunate induces a dose-dependent suppression of BGC-823 tumor growth in nude mice,which might be related to the down-regulation of VEGF and the up-regulation of Calpain2.