猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

张清真，陶 洁，殷秀辰，熊年年，李 星，刘惠莉*

（1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106；4上海种猪工程技术研究中心，上海 201302）

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

张清真1，2，陶 洁1，3，4*，殷秀辰1，3，熊年年1，2，李 星1，2，刘惠莉1，3，4**

（1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106；4上海种猪工程技术研究中心，上海 201302）

以乳化灭活的猪流行性腹泻病毒（PEDV）作为抗原，免疫大白兔，制备兔抗PEDV高免血清，纯化抗PEDV IgG并进行生物素标记。以体外表达的PEDV S蛋白作为抗原，商品化的PEDV单克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的IgG作为检测抗体，建立了检测PEDV的生物素-亲和素系统的双抗夹心ELISA方法。结果表明：该方法最低检测限量为20 ng/μL，且稳定性和特异性较好。对25份临床猪腹泻样品进行检测，3份检出PEDV阳性，与RT-PCR法的符合率为100%。本研究为PEDV临床检测提供了新方法，也为猪腹泻病原的多重检测技术研究奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒检测；重组S蛋白；双抗体夹心ELISA

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）首次在英国报道［1］，是由冠状病毒属猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以食欲下降、腹泻、呕吐和脱水为特征的猪急性肠道传染病［2］。2013年以来，我国大部分地区爆发仔猪腹泻疫情，死亡率高达100%，2013年5月PED在美国首次爆发，造成300万头仔猪死亡［3］；同年，古巴也报道了PED的流行［4］。王娜等［5］对2013—2014年辽宁省9个市228份腹泻病料进行RT-PCR检测，发现PEDV的阳性率为37.72%，为猪腹泻的主要病原，且流行范围广，季节性不明显，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前临床上对该病的诊断方法主要有RTPCR、免疫荧光实验和ELISA等，病毒分离周期长，且难度大；RT-PCR方法应用较多，但难以满足大量样品普查的需求。目前，用于检测PEDV抗体的间接ELISA方法被大量用于临床实践。时晓丽等［6］以纯化细胞毒作为抗原，建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法，可用于PEDV抗体检测，但间接ELISA方法不利于早期发现病毒感染。李一经等［7］用纯化的病毒免疫小鼠制备单抗，建立了检测猪排泄物中PEDV的双抗夹心ELISA方法。本研究以体外重组表达S蛋白作为抗原，商品化单抗作为捕获抗体，将生物素标记IgG抗体作为二抗，建立检测PEDV的生物素-亲和素系统双抗夹心ELISA方法，用于猪场大量样品中PEDV的检测和普查，以期为猪腹泻多病原检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

猪流行性腹泻细胞毒、重组表达的猪流行性腹泻病毒S蛋白均由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠；SEPPIC ISA760佐剂由上海SEPPIC公司惠赠；抗PEDV S蛋白特异性单克隆抗体（IgG2a亚型）购自韩国MEDIAN公司；硫酸铵、脱脂乳、BSA为sigma产品；马血清为Gibco公司产品；预染蛋白质分子量标准、Protein G亲和层新柱、Sulfo-NHSBiotin、HABA/Streptavidin购自美国Thermo公司；辣根过氧化物酶-链酶亲和素（HRP-Streptavidin）为Biolegend产品；无蛋白封闭液、BSA、脱脂乳购自生工生物工程（上海）股份有限公司；TMB购自北京必得公司。

1.2 兔抗PEDV高免血清的制备

用注射器将乳化好的SEPPIC760佐剂和PEDV细胞毒于背部皮下多点免疫兔子，7 d后二免。二免3 d后心脏采血，制备抗血清，分装，－20℃保存。

1.3 兔抗PEDV IgG粗提

按常规方法［8］将分离的兔血清5 m L和等体积的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS：100 mmol/L磷酸二氢钠，150 mmol/L氯化钠；pH 7.2）混匀，0.45μm滤膜过滤后逐滴加入10 mL饱和硫酸铵溶液（pH 7.0）使其成50%饱和度，边滴加边搅拌，充分混合后4℃静置过夜，4℃、6 000 r/min离心30 min，弃上清。沉淀用10 mL PBS溶解，再逐滴加入5 mL饱和硫酸铵溶液，使其成33%饱和度，边滴加边搅拌，同上离心，弃上清，重复3次后，所得沉淀为IgG抗体，用适量PBS液溶解，并用100倍体积的PBS 4℃透析48 h，期间更换PBS 4—5次。透析后的样品于－20℃保存备用。

1.4 兔抗PEDV IgG纯化

按照说明书，利用Protein G亲和层析柱纯化兔抗PEDV粗提IgG抗体，SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计检测纯化后纯度和浓度。采用Western Blot方法检测纯化后抗体反应原性［9］。

1.5 抗PEDV IgG生物素标记

按照说明书进行抗体标记。用脱盐柱去除游离的生物素，生物素标记后的抗体浓度用微量紫外分光光度计计算。HABA/Avidin试剂检测标记效率；用终质量浓度为5μg/mL的PEDV S蛋白包被酶标板，100μL/孔，间接ELISA评估标记效果［10］。在标记后的0 d、30 d、90 d和180 d分别检测生物素标记抗体活性即其稳定性。

1.6 BAS-ELISA检测体系的建立

用棋盘滴定法进行条件优化［11］。碳酸盐缓冲液稀释抗PEDV S蛋白单克隆抗体，包被96孔聚乙烯板，100μL/孔，终质量浓度为0.15μg/mL、0.3μg/mL、0.6μg/mL。96孔板用薄膜密封，4℃孵育过夜。洗涤缓冲液（0.05%Tween20-PBS，pH 7.2）洗涤3次，拍干后，加入无蛋白封闭液封闭，每孔250μL，37℃孵育2 h；洗涤；每孔加入50μL样品，设置PBS为对照孔，37℃孵育1 h；洗涤；分别加入2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL和16μg/mL生物素化抗体，37℃避光孵育1 h；洗涤；每孔分别加入1∶1 000、1∶2 000和1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记链酶亲和素50μL，37℃避光孵育1 h；洗涤；每孔加入TMB显色液50μL，37℃避光孵育15 min；用2 mol/L H2SO450μL/孔终止反应。用酶标仪读取A450 nm处的吸光值。若检测样品吸光值大于对照孔吸光值的2倍，则判定为阳性。

1.7 最低检出限量测定

将PEDV S蛋白进行2倍倍比稀释，用建立的BAS-ELISA方法检测蛋白最低检出量。

1.8 临床样品检测

采集上海、江苏等地猪场疑似PEDV猪腹泻病料25份，刮取肠内容物，用建立的BAS-ELISA方法检测。

1.9 RT-PCR检测临床样品

根据参考文献［12］，合成1对扩增大小为654 bp的PEDV检测引物，引物序列为PEDV-S-F：5’-CGGGTTACCAGCTTTATTTACATAAGG-3’；PEDV-S-R：5’-CGTCATTAATATTAAACCTCAGAGC-3’。利用RT-PCR方法对25份临床样品进行扩增检测，比较两种方法检测结果的符合率。

2 结果与分析

2.1 兔抗PEDV IgG抗体的纯化

用饱和硫酸铵沉淀法粗提兔抗PEDV IgG抗体，再用Protein G亲和层析柱纯化，测定纯化IgG抗体质量浓度为2 mg/mL。取5μg PEDV S蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后利用Western Blot检测纯化的IgG抗体（图1）。在约110 kD处可见清晰的条带，说明纯化的IgG抗体具有良好的特异性和反应原性。

2.2 生物素标记IgG抗体检测

将5.9μL Sulfo-NHSBiotin溶液加入200μL 1 mg/mL脱盐后的IgG抗体溶液，用HABA/Avidin检测标记效率。结果表明：1 mmol/L IgG抗体标记了2.8 mmol/L生物素分子。用间接ELISA在标记后的0 d、30 d、90 d和180 d分别检测生物素化IgG，结果表明其稳定性较好。

2.3 BAS-ELISA检测体系条件优化

经棋盘法滴定及多次试验，获得了BAS-ELISA方法的最佳条件（表1）。

图1 W estern Blot检测纯化的抗PEDV IgG抗体Fig.1 Detection of purified anti PEDV IgG antibody by W estern Blot

表1 ELISA检测方法的反应条件优化结果Table 1 Optim ization of reaction conditions for ELISA detection

2.4 最低检出限量

用建立的BAS-ELISA方法检测PEDV S蛋白的最低检出限量为20 ng/μL。用建立的BAS-ELISA检测方法进行3次重复试验，结果一致，表明建立的方法重复性较好。

2.5 RT-PCR检测临床样品

RT-PCR法检测25份疑似PEDV猪腹泻样品，检出3份阳性样品。扩增这3个阳性样品的S基因，测序结果证实这3个分离毒株为PEDV。

2.6 双抗夹心法检测临床样品

用建立的BAS-ELISA方法检测25份疑似猪腹泻样品，3份为PEDV阳性，与RT-PCR检测方法的符合率为100%。

3 讨论

由于PEDV流行毒株细胞适应性差，难以获得高纯度的病毒抗原，本研究选择以重组表达S蛋白作为包被抗原来建立检测方法。本研究利用商品化的抗PEDV单克隆抗体作为捕获抗体，提高了双抗夹心ELISA方法的特异性；用生物素化IgG作为二抗，由于多克隆抗体能够识别多个抗原位点，也保证了该方法的高识别率。此外，生物素-亲合素系统是一种生物级联放大反应系统，其结合双抗体夹心ELISA方法进一步提高了该方法的灵敏度，该方法对PEDV S蛋白最低检测限量为20 ng/μL，特异性较好。

利用PEDV细胞毒免疫大白兔，制备抗血清，用饱和硫酸铵沉淀法粗提兔抗PEDV IgG，用Protein G亲和层析柱纯化，将纯化前后样品进行SDS-PAGE检测，纯化效果较好，对纯化前后样品浓度检测，纯化后得率高达75%，说明该纯化方法是在对多抗纯度要求高的情况下的一种比较简便且高效的抗体纯化方法。

用本研究建立的方法对25份临床样品进行检测，检出3份阳性样品，与RT-PCR法的符合率为100%，证实了建立的双抗夹心ELISA方法的有效性，说明该方法可用于临床样品的检测。但由于目前检测样品较少，部分指标还需要加大样品的检测数量加以优化和完善。李一经等［7］用建立的双抗夹心ELISA方法和PCR方法检测48份临床样品，阳性样品分别检出19份和21份，阳性符合率为90.5%，阴性符合率为100%。雷利等［13］用PEDV M蛋白亲和层析纯化法制备PEDV-IgY卵黄抗体和鼠抗PEDVIgY多克隆抗体建立该病毒的双抗夹心ELISA法，用建立的ELISA方法和PCR方法对100份临床样品进行检测，分别检出6份和8份阳性样品，阳性符合率为96%，阴性符合率为100%。

本研究建立的PEDV BAS-ELISA方法弥补了现有PEDV检测方法的不足，为猪病毒性腹泻多重病原检测奠定了基础。

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（责任编辑：闫其涛）

Establishment of double antibody sandwich ELISA for detection of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）

ZHANG Qing-zhen1，2，TAO Jie1，3，4*，YIN Xiu-chen1，3，4，XIONG Nian-nian1，2，LIXing1，2，LIU Hui-li1，3，4**（1Institute of Animɑl Scienceɑnd Veterinɑry Medicine，Shɑnghɑi Acɑdemy of Agriculturɑl Sciences，Shɑnghɑi 201106，Chinɑ；2College of Fisheriesɑnd Life Science，Shɑnghɑi Oceɑn University，Shɑnghɑi201306，Chinɑ；3Shɑnghɑi Key Lɑborɑtory of Agriculturɑl Genetic Breeding，Shɑnghɑi201106，Chinɑ；4Shɑnghɑi Engineering Reseɑrch Center of Breeding Pig，Shɑnghɑi201302，Chinɑ）

The emulsified and inactivated porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）was used as antigen to prepare the rabbit anti PEDV hyperimmune serum，and the anti PEDV IgG was purified and labeled with biotin. A double sandwich ELISA method for the detection of biotin avidin system of PEDV was established，taking in vitro expression of PEDV S protein as antigen，commercial PEDV monoclonal antibody as capture antibody，biotin labeled IgG as detection antibody.The results showed that the detection limit of themethod was 20 ng/μL，and the stability and specificity were better.Twenty-five samples of swine diarrhea were detected，and positive PEDV was detected in 3 samples.The coincidence rate with RT-PCR was100%.This study provides a new method for the clinical detection of PEDV，and lays a foundation for the study ofmultiple detection techniques.

PEDV detection；Recombinant S protein；Double antibody sandwich ELISA

S852.65

A

1000-3924（2017）01-134-04

2015-04-27

沪农科攻字（2013）第5-5号；沪农科攻字（2013）第3-6号；沪农科产字（2016）第6号；沪农青字（2016）第1-35号

张清真（1989—），女，硕士，从事动物病毒学研究

*共同第一作者

**通信作者，E-mail：huilil＠163.com