虎奶菇多糖纳米硒对叔丁基过氧化氢诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用

吴建国，马利，杨彬君，吴岩斌，吴锦忠，黄家兴（.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州50；.福建中医药大学药学院，福建福州50；.香港理工大学应用生物及化学科技学系，香港999077）

虎奶菇多糖纳米硒对叔丁基过氧化氢诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用

吴建国1，马利2，杨彬君2，吴岩斌1，吴锦忠1，黄家兴3
（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建中医药大学药学院，福建福州350122；3.香港理工大学应用生物及化学科技学系，香港999077）

目的观察虎奶菇多糖纳米硒（PTR-SeNPs）对叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用。方法不同给药浓度的PTR-SeNPs作用24 h，5 μmol／L的t-BHP作用HepG2细胞1 h，建立细胞氧化应激损伤模型，用MTT法检测细胞活力。结果10-1～10-4μmol／L的PTR-SeNPs能显著改善t-BHP对HepG2细胞细胞增殖的抑制作用。结论PTR-SeNPs对HepG2细胞氧化损伤具有明显的保护作用。

虎奶菇多糖纳米硒；叔丁基过氧化氢；HepG2细胞；氧化损伤；保护作用

我们前期研究利用虎奶菇菌核多糖作为封端剂，在亚硒酸钠（硒源）和抗坏血酸（还原剂）的还原系统中成功制备出一种大小可控且高度稳定的新型纳米硒，即虎奶菇多糖纳米硒（PTR-SeNPs）。研究结果显示，以PSP修饰的纳米硒具有优质的生物理化特性，较纳米硒分散更均匀，不易聚集［1］。本文研究PTR-SeNPs对t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用。

1 材料与仪器

1.1 材料PTR-SeNPs（香港理工大学应用生物及化学科技学系黄家兴副教授制备并提供，初始浓度为1.29 mol／L）；HepG2细胞（美国模式培养物集存库（ATCC细胞库）；磷酸盐缓冲盐溶液PBS、DMEM培养液、胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；胎牛血清FBS（美国Gibco公司）；0.22 μm微孔滤膜（美国Corning公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、叔丁基过氧化氢（t-BHP）（美国Sigma公司）；二甲基亚砜DMSO、青霉素-链霉素双抗试剂（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）。

1.2 仪器BCD-518WSA冰箱（中国海尔集团有限公司）；SW-CJ-1FDA超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；Eppendorf移液器、5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Anke TDL-50B离心机（上海安亭科学仪器厂）；HF212UV CO2培养箱（香港Heal Force公司）；LX-800酶标仪（美国Bio-tek公司）；P.O.Box 649 CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）。

2 方法

2.1 含药培养液的制备取PTR-SeNPs、t-BHP用含10%FBS的DMEM培养液（含1%青霉素-链霉素）稀释后，配置成不同终浓度的含药培养液，以0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后密封，保存于4℃，备用。

2.2 HepG2细胞培养HepG2细胞置于含10% FBS的DMEM培养液（含1%青霉素-链霉素）的培养瓶中，在37℃、5%CO2空气饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养。

2.3 PTR-SeNPs和t-BHP对HepG2细胞增殖的影响取对数生长期的HepG2细胞，于96孔板中每孔接种1×105／mL细胞悬液100 μL，每组6个复孔，孵育24 h后，加入10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 μmol／L的PTR-SeNPs，或含t-BHP终浓度为0、2.5、5、10、20、40、60、80、120、240 μmol／L的完全培养基，每孔100 μL作用1和2 h后，吸弃各孔培养基，分别加入100 μL的1 mg／mL MTT，37℃继续孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振荡10 min，用酶联免疫分析仪在570 nm波长处检测各孔光密度（OD）值。根据下式计算细胞的增殖抑制率：

2.4 PTR-SeNPs对HepG2细胞氧化损伤的保护作用取对数生长期的HepG2细胞，于96孔板中每孔接种1×105／ml细胞悬液100 μL，每组6个复孔，贴壁24 h，进行分组。空白组继续以100 μL的培养基孵育24 h，不加任何干预因素；模型组以100 μL培养基培养23 h后，改换含等体积的5 μmol／L的t-BHP培养基溶液继续培养1 h；PTRSeNPs给药组在细胞培养体系中，加入100 μL的1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol／L的PTR-SeNPs干预23 h，改换50 μL的10 μmol／L的t-BHP和50 μL的2×10-4、2×10-3、2×10-2、2×10-1、2、20 mol／L的PTR-SeNPs培养1 h，加入20 μL 5%的MTT盐酸缓冲盐溶液，37℃孵育4 h，去除上清液，加入150 μL的DMSO溶液振荡10 min，使结晶物充分溶解，置入用酶联免疫分析仪在570 nm处检测吸光度值，计算各组的细胞活力。

3 结果

3.1 PTR-SeNPs和t-BHP对HepG2细胞的生长抑制作用见表1。

表1 不同浓度PTR-SeNPs对HepG2细胞增殖的影响

表1显示不同给药浓度的PTR-SeNPs均能显著抑制细胞的增殖（P＜0.001），当浓度为10-4～1 μmol／L时，对HepG2细胞具有一定的抑制作用，抑制率为11.86%～17.80%。当浓度为10 μmol／L，PTRSeNPs对HepG2细胞的抑制作用较强，抑制率达到36.44%。图1显示药物作用1 h后，不同浓度的t-BHP均能显著抑制HepG2细胞的增殖（P＜0.001），呈剂量依赖关系；药物作用2 h后，t-BHP给药浓度≤60 μmol／L时，对细胞增殖的抑制作用随着浓度的增加而增强（P＜0.001），呈剂量依赖关系，但当给药剂量大于此浓度，抑制率均大于90%，剂量依赖关系不明显。综合考虑，本实验采用5μmol／L的t-BHP作用时间1 h，其抑制率为37.06%（P＜0.001）作为HepG2细胞氧化损伤模型建立的条件。

3.2 PTR-SeNPs对HepG2细胞氧化损伤的保护作用见表2。由表2可知，当PTR-SeNPs终浓度为10 μmol／L时，对HepG2细胞有显著抑制作用，其细胞活力显著低于模型组（P＜0.01）。当给药浓度为1 μmol／L时，其细胞活力与模型组无显著性差异。当PTR-SeNPs给药浓度≤10-1，其细胞活力大于模型组，具有明显的保护作用。细胞活力随着浓度的降低，细胞活力增强，与PTR-SeNPs本身对HepG2细胞具有一定的抑制作用有关。

图1 不同浓度的t-BHP对HepG2细胞增殖抑制作用图

表2 不同浓度PTR-SeNPs对t-BHP诱导HepG2细胞氧化损伤的保护作用

4 讨论

近年来，纳米硒替代无机硒的研究引起了广泛的关注，因其具有生物利用度高、活性强、毒性低的优点。对纳米硒的体内活性研究结果表明，灌胃给予纳米硒能够明显减小因环磷酰胺引起的Swiss albino小鼠肝损伤及基因毒性，主要表现为显著降低小鼠体内的MDA和ROS水平，提高GSH含量，恢复抗氧化酶活性，减少染色体畸变以及淋巴球和骨髓的DNA损伤［2］。本研究结果证实PTR-SeNPs能显著改善t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤。

［1］WU H L，LI X L，LIU W，et al.Surface decoration of selenium nanoparticles by mushroom polysaccharide-protein complexes to achieve enhanced cellular uptake and anti-cancer activity［J］.J Mater Chem，2012，22（19）：9602-9610.

［2］BHATTACHARJEE A，BASU A，GHOSH P，et al.Protective effect of Selenium nanoparticle against cyclophosphamide induced hepatotoxicity and genotoxicity in Swiss albino mice［J］.J Biomater Appl，2014，29（2）：303-317.

R285.5

A

1000-338X（2017）01-0045-02

2017-01-03

吴建国（1982—），男，助理研究员，主要从事药用真菌的药效物质研究。

黄家兴（1979—），男，副教授。E-mail：kahing.wong@polyu. edu.hk