金线莲乙醇提取物及不同极性部分的体外抗氧化活性作用

马利，吴岩斌，张超，吴建国，易骏，郑承剑，吴锦忠（.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州50；.福建教育学院理科部，福建福州5000；.第二军医大学药学院，上海004）

金线莲乙醇提取物及不同极性部分的体外抗氧化活性作用

马利1，吴岩斌1，张超1，吴建国1，易骏2，郑承剑3，吴锦忠1
（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建教育学院理科部，福建福州350001；3.第二军医大学药学院，上海200433）

目的研究金线莲乙醇提取物及其不同极性部位的体外抗氧化活性作用。方法用80%乙醇制备金线莲乙醇总提取物（CE），以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取CE得到石油醚部位（PEF）、乙酸乙酯部位（EAF）、正丁醇部位（BF）、水部位（AF），用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、羟基自由基清除法测定。结果金线莲乙醇提取物及其不同极性部位对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基有不同程度的清除作用，其中乙酸乙酯部位的清除能力最强。结论金线莲乙醇提取物及其不同极性部位具有一定的抗氧化和清除自由基的作用。

金线莲；乙醇提取物；极性部位；抗氧化

金线莲来源于兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii的新鲜或干燥全草，具有清热凉血、祛风利湿的功效［1］。金线莲在福建、台湾和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，常作为滋补强壮品。近年来国内外学者对金线莲的化学成分和药理作用进行了较多研究，发现其化学成分主要为黄酮类、多糖类、内酯类成分［2-4］，具有降血糖、保肝、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等药理活性［5-9］，临床用于治疗手足口病、高尿酸血症、肝炎等［10-12］。随着对金线莲生物活性研究的深入，其药用价值得到不断体现。目前，已有金线莲乙醇提取物体外抗氧化的报道，但是对其体外抗氧化的活性部位研究的报道较少。我们采用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羟基自由基清除能力体外抗氧化模型，进行金线莲抗氧化活性部位的筛选，为研究其抗氧化活性的物质基础及作用机制提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂金线莲由儒兰（福建）生物科技有限公司提供，经福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定为兰科植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii的全草，标本存放在福建中医药大学中西医结合研究院。

ABTS试剂（美国Sigma公司）；DPPH（日本和光纯药株式会社）；BHT（海华蓝生物科技有限公司，批号：26973）；甲醇（天津市致远化学试剂有限公司）；乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；磷酸二氢钠（天津市福晨化学试剂厂）；磷酸氢二钠（上海联试化工试剂有限公司）；过硫酸钾（天津市永大化学试剂有限公司）；硫酸亚铁（国药集团化学试剂有限公司）；水杨酸钠（天津市福晨化学试剂厂）；过氧化氢（天津市致远化学试剂有限公司）；水为蒸馏水。

1.2 仪器旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；DLSB-5／20低温冷却液循环泵、HH-S恒温水浴锅（郑州长城科技工贸有限公司）；CP225D十万分之一天平（德国赛多利斯公司）；TECAN Infinite200 PRO多功能酶标仪（帝肯（上海）贸易有限公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法

2.1 样品提取与制备称取100 g金线莲粉末，用15倍量80%乙醇回流提取1 h，过滤，滤渣同法提取2次，合并3次滤液，减压浓缩，即得金线莲总提取物（CE）。将金线莲总提物，加入一定量蒸馏水溶解，混匀，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，收集石油醚、乙酸乙酯、正丁醇不同极性部位萃取液，分别减压浓缩，得到PEF、EAF、BF，萃取后剩余部分浓缩后得到AF。

2.2 抗氧化活性的测定

2.2.1 清除DPPH自由基分别取2 mL不同浓度0.25～2 mg／mL的金线莲总提取及不同极性部位供试品溶液，加入0.2mM DPPH甲醇溶液2 mL，避光反应30 min，以2 mL不同浓度的BHT为阳性对照，空白对照用80%甲醇代替样品溶液，在517 nm波长处测吸光度值。

DPPH自由基清除活力＝（1－A1／A0）×100%

式中A0为空白对照的吸光度，A1为供试品的吸光度。

2.2.2 清除ABTS自由基取7 mM的ABTS与2.45 mM过硫酸钾等体积混合，23℃暗处反应12～16 h，得到ABTS.＋。用蒸馏水稀释ABTS.＋溶液使其在734 nm下的吸光度值在0.7±0.02。取ABTS.＋溶液（吸光度在0.7±0.02）3.9 mL分别加入0.1 mL不同浓度的BHT作为阳性对照，0.1 mL 80%甲醇溶解0.25～3 mg／mL的金线莲总提取物及其不同极性部位供试品溶液，空白对照用80%甲醇代替样品溶液摇匀，23℃放置6 min，在734 nm波长处测吸光度。

ABTS自由基清除率＝（1－A1／A0）×100%

式中A0为空白对照的吸光度，A1为供试品的吸光度。

2.2.3 羟自由基清除能力分别取1 mL不同浓度1～3 mg／mL的金线莲总提取物及不同极性部位供试品溶液依次加入1.5 mM硫酸亚铁1 mL、20 mM水杨酸钠0.3 mL、6 mM过氧化氢0.7 mL，摇匀，37℃水浴下反应30 min，以抗坏血酸作为阳性对照，以80%甲醇代替样品溶液作为空白对照，用水代替过氧化氢溶液作为样品对照，在510 nm波长处测定吸光度值。

羟基自由基清除率＝（1－A1／A0）×100%

式中A0为空白对照的吸光度，A1为供试品的吸光度。

3 结果

3.1 清除DPPH自由基作用金线莲80%乙醇提取物及各不同极性部位对DPPH自由基均有一定的清除作用，在试验浓度范围内呈明显量效关系，其对DPPH自由基的清除能力大小依次为BHT＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞总提取物＞水部位，结果见图1。

图1 金线莲乙醇提取物及不同极性部位对DPPH自由基的清除作用

在相同质量浓度下，EAF部位清除DPPH自由基活性最强，在2 mg／mL时EAF部位对DPPH自由基的清除率达到94.11%；AF部位对DPPH自由基的清除能力相对较低，在2 mg／mL时，其对DPPH自由基的清除率为24.99%。

3.2 清除ABTS自由基作用金线莲80%乙醇提取物及各不同极性部位对ABTS自由基均有一定的清除作用，在试验浓度范围内呈明显量效关系，其清除能力大小依次为BHT＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞总提取物＞水部位，结果见图2。

图2 金线莲乙醇提取物及不同极性部位对ABTS自由基清除作用

相同质量浓度下，EAF部位对ABTS自由基的清除作用最强，3 mg／mL时最大清除率达57.54%；其它部位对ABTS自由基的清除率相对较低，均未超过30%。

3.3 清除羟自由基作用除水部位外，金线莲80%乙醇提取物及各不同极性部位对ABTS自由基均有一定的清除作用，在试验浓度范围内呈明显量效关系，其清除能力大小依次为BHT＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞总提取物＞水部位，结果见图3。

图3 金线莲乙醇提取物及不同极性部位对·OH自由基的清除作用

在3 mg／mL时，乙酸乙酯部位对羟基自由基的清除率达到60.17%，其余部位对羟基自由基的清除率相对较低，均未超过50%；石油醚部位部位在试验浓度范围内对羟基自由基几乎没有什么清除作用。

4 讨论

金线莲乙醇提取物体外抗氧化试验表明：金线莲80%醇提取物及其石油醚部位酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位均有抗氧化活性，且不同极性部位的抗氧化活性差异较大。此外，相同极性部位在不同的自由基清除模型中，其清除能力呈不同结果。在DPPH自由基清除模型中，抗氧化活性强弱顺序为：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞80%醇提物＞水部位；在ABTS自由基清除模型中，抗氧化活性强弱顺序为：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞80%醇提物＞水部位；在羟基自由基清除模型中，抗氧化活性强弱顺序为：乙酸乙酯部位＞80%醇提物＞水部位＞正丁醇部位＞石油醚部位。这可能与金线莲提取物的不同极性部位中所含抗氧化活性成分的种类和结构有关，因而在不同的抗氧化体系中，金线莲提取物的不同极性部位的抗氧化作用不同。

金线莲80%提取物乙酸乙酯萃取部位相对于其它极性部位表现出较强的清除自由基能力，可以作为金线莲抗氧化活性研究的主要极性部位进行深入研究，并进一步分离其中的抗氧化活性成分。

［1］黄有霖.福建中药材标准［S］.福州：海风出版社，2006：154.

［2］张赛男.不同种源金线莲黄酮含量对比研究［J］.北京农业，2014（36）：126-12.

［3］吴岩斌，张秀才，易骏，等.柱前衍生化HPLC法测定不同基源金线莲多糖的单糖组成［J］.中国药房，2015（15）：2116-2119.

［4］万婷，熊富良.HPLC-ELSD法测定金线莲提取物中金线莲苷［J］.中成药，2014，36（7）：1485-1488.

［5］唐菲，张小琼，徐江涛，等.金线莲降血糖活性部位的筛选［J］.中草药，2011，42（2）：340-342.

［6］BIYU ZENG，MINGHUA SU，QINGXI CHEN，et al.Antioxidant and hepatoprotective activi ties of polysaccharides from Anoectochilus roxburghii［J］.Carbohydrate Polymers，2016，153：391-398.

［7］张赛男.金线莲多糖降血脂功能的实验研究［J］.云南中医中药杂志，2014，35（12）：64-66.

［8］邹金美，王兵丽，赵晓丹，等.福建金线莲组培苗和移栽苗主要活性成分及抗氧化性的研究［J］.食品工业科技，2014，35（23）：136-139.

［9］钟添华，黄丽英.金线莲水提物给药前后肿瘤细胞蛋白质组的差异比较［J］.中国医院药学杂志，2011，31（8）：623-626.

［10］李芹，周文，刘路，等.金线莲喷雾剂治疗手足口病口腔疱疹临床观察［J］.福建中药，2012，43（3）：9-10.

［11］陈学香，夏向南.金线莲治疗高龄老年高尿酸血症疗效观察［J］.中华保健医学杂志，2010，12（4）：308-309.

［12］陈晓.金线莲的化学成分及临床应用［J］.海峡药学，2014，26（11）：156-157.

R285.5

B

1000-338X（2017）01-0013-03

2016-10-25

国家自然科学基金资助课题（81603230），福州市科学技术局市校合作项目（2014-G-61），福建中医药大学校管重点学科专项（X2014138-学科）

马利（1991—），女，2015级生药学专业硕士研究生，主要从事中药活性成分及品质评价研究。

吴锦忠（1965—），男，教授。E-mail：jinzhongfj@126.com