L-异亮氨酸生产菌Corynebacterium glutamicum JHI3-156中突变酶TD1及AHAS1的初研究

吴锦荣，李西君，刘世周，薄文文，王玉杰

（1.新疆阜丰生物科技有限公司，新疆乌鲁木齐830000；2.山东阜丰发酵有限公司，山东临沂276600）

L-异亮氨酸生产菌Corynebacterium glutamicum JHI3-156中突变酶TD1及AHAS1的初研究

吴锦荣1，李西君1，刘世周2，薄文文2，王玉杰2

（1.新疆阜丰生物科技有限公司，新疆乌鲁木齐830000；2.山东阜丰发酵有限公司，山东临沂276600）

苏氨酸脱水酶（TD）和乙酰羟基氨酸合酶（AHAS）是谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）合成L-异亮氨酸的关键酶。TD受L-异亮氨酸反馈抑制，AHAS受三支链氨基酸的反馈抑制。通过研究分析L-异亮氨生产菌C.glutamicum JHI3-156中突变型TD1及AHAS1，发现TD1有一个突变氨基酸，AHAS1有三个突变氨基酸；将TD，TD1，AHAS和AHAS1在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达，经提取纯化及酶活测定，发现相比野生型TD，突变型TD1体现较高的酶活水平，完全不再受L-异亮氨酸反馈抑制；相比野生型AHAS，突变型AHAS1对较高浓度的L-异亮氨酸更耐受。

突变型TD1；突变型AHAS1；酶活测定；L-异亮氨酸；抗反馈抑制

谷氨酸棒杆菌中，L-异亮氨酸合成代谢途径中苏氨酸脱水酶（TD）受L-异亮氨酸抑制[1]；乙酰羟基氨酸合酶（AHAS）受三支链氨基酸反馈抑制，且AHAS催化丙酮酸形成α-乙酰乳酸或者催化2-酮丁酸形成乙酰羟基丁酸（图1），此反应决定着相关代谢流到不同的终产物[2]。因此找寻具有抗反馈抑制能力的突变型TD及AHAS对L-异亮氨酸生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验菌株、质粒及引物

试验所用的菌株、质粒如表1，2所示，重组载体构建所需引物如表3所示。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 培养基

LB培养基：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物，用于E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）菌株的培养。

表1 菌株

表2 质粒

表3 引物

改良的LB培养基：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物，0.5%葡萄糖。用于C.glutamicum JHI3-156及C.glutamicum ATCC 13869的培养。

固体培养基琼脂粉用量为1.8%；转化子筛选及质粒稳定性的维持需添加30 μg/mL的卡那霉素；基因诱导表达加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。

1.2.2培养条件

E.coli菌种培养条件：LB液体培养基（用移液枪吸取E.coli菌种甘油保藏液80 μL，接种至装有8 mL LB液体的试管中），37℃，250 r/min振荡培养8.5 h。

C.glutamicum种子培养：改良LB液体培养基（用接种环挑取培养皿中肉眼可见的C. glutamicum菌种单菌落，接种至装有20 mL改良LB液体的100 mL三角瓶中），30℃，250 r/min振荡培养13.5 h。

E.coli转化细胞培养：用移液枪吸取700 μL转化后菌液涂布于LB固体培养基，37℃静置培养14 h；再用接种环挑取先前培养好的单个菌落接种至含有7 mL LB液体的试管中，37℃，200 r/min振荡培养11.5 h，用于重组质粒验证。

1.3 分子生物学实验

1.3.1 C.glutamicum基因组DNA的提取

使用细菌基因DNA提取试剂盒提取C. glutamicum基因组，首先破壁处理，在I型溶液中加入5 μL质量浓度为100 mg/mL的溶菌酶，37℃破壁处理30 min，后续提取均按照试剂盒中说明的步骤进行。

1.3.2 PCR扩增和产物的纯化

以基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为50 μL（5 μL 10×Ultra-Pfu PCR Buffer，4 μL dNTP mixtrure，正反向引物1 μL，模板1 μL，0.5 μL Ultra-Pfu DNA聚合酶，ddH2O补充至50 μL）。扩增程序为：98℃预变性5 min；98℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸（延伸时间按1 Kb/min计算），35个循环；72℃再延伸10 min；4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，切割目的条带，纯化回收PCR产物。

1.3.3 PCR产物、质粒酶切及纯化

1）PCR产物酶切体系

酶切反应体系50 μL的单酶双切：2 μL限制性内切酶A，5 μL 10×Buffer酶A，5 μL PCR产物（由DNA浓度计算加入对应体积），ddH2O补充至50 μL，37℃酶切4 h。酶切反应体系50 μL的双酶双切：1 μL限制性内切酶A，1 μL限制性内切酶B，5 μL 10×Buffer酶A和酶B，5 μL PCR产物（由DNA浓度计算加入对应体积），ddH2O补充至50 μL，37℃酶切4 h。

2）质粒酶切体系

酶切反应体系50 μL的单酶单切：1 μL限制性内切酶A，5 μL 10×Buffer酶A，5 μL质粒DNA（由DNA浓度计算加入对应体积），ddH2O补充至50 μL，37℃酶切2 h。酶切反应体系50 μL的双酶双切：1 μL限制性内切酶A，1 μL限制性内切酶B，5 μL 10×Buffer酶A和酶B，5 μL质粒DNA（由DNA浓度计算加入对应体积），ddH2O补充至50 μL，37℃酶切2 h。纯化回收质粒DNA及酶切PCR产物。

1.3.4 PCR产物和质粒的连接

连接体系（20 μL）：依次在PCR管中加入2 μL 10×T4 ligase Buffer，50 ng（20～100 ng）酶切纯化后质粒，按摩尔比1∶10（单酶切）或1∶3（双酶切）加入酶切纯化后的PCR产物，1 μL T4 DNA连接酶，最后ddH2O补至20 μL，22℃连接1.5 h。

1.3.5 感受态细胞的制备及转化

连接产物参照徐大庆等[3]的化学法转化E.coli DH5α。将构建好的重组质粒按照徐大庆等的化学法转入E.coli BL21（DE3）中。

1.3.6 阳性转化子的鉴定

E.coli BL21（DE3）转化子经液体培养后，提取质粒，进行单酶切和PCR验证获阳性转化子。

1.4 重组E.coli BL21（DE3）菌种的蛋白表达分析

用IPTG对鉴定成功的E.coli BL21（DE3）工程菌进行诱导表达，同时分析目标基因的表达状况。测定诱导培养重组菌的OD600nm，按1 mL OD600nm-1=2计算，取一定体积的该重组菌菌液，10 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加150 μL ddH2O重悬后，取15 μL重悬菌液，加入15 μL 2×Buffer混匀，沸水煮沸5 min，将处理好的样品经5%浓缩胶和12%分离胶的SDS-PAGE电泳分离，用考马斯亮蓝R-250染色，ddH2O慢摇脱色，获得E.coli BL21（DE3）重组菌蛋白电泳图谱。

1.5 E.coli BL21（DE3）工程菌中目标蛋白的Ni柱纯化

当E.coli BL21（DE3）重组菌OD600nm值为0.6～0.7时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达4.5 h，8 500 r/min高速离心10 min后收集菌体，加入30 mL起始缓冲液（4.77 g/L HEPES，29.22 g/L NaCl及0.68 g/L咪唑，pH 8.0）洗涤3次后，再加入15 mL起始缓冲液重悬；然后用细胞破碎仪按照功率40%，超声3 s，停2 s，共处理15 min进行超声破壁，高速冷冻离心后取上清液，进行Ni柱纯化：1）用150 mL经冰浴的初始缓冲液平衡柱子；2）将紫外检测仪的开关打开，待基线平直时，以0.8 mL/min的流速将过膜后的上清液上柱；3）用100 mL初始缓冲液洗涤杂蛋白，等基线平直后加入最终缓冲液（4.77 g/L HEPES，29.22 g/L NaCl及34.04 g/L咪唑，pH 8.0）进行洗脱；4）紫外检测仪数值显示大于180时，收集穿过液，进行SDS-PAGE试验。

1.6 酶活测定分析

1.6.1 TD酶活检测

TD酶活性的测定参考文献[4]，酶反应体系为1 mL：40 mmol/L的L-苏氨酸，pH 8.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液，1 mmol/L的磷酸吡哆醛。向酶反应体系中加入一定体积的纯酶液，22℃孵育15 min，加入1 mL 1%氨基脲盐及0.9%醋酸钠混合液终止酶学反应。用紫外分光光度计在254 nm条件下检测氨基脲衍生物的OD值来确定2-酮丁酸的量。根据比尔定律：A=εbc，ε254nm=0.52 mmol/cm，计算氨基脲衍生物的生成量，从而间接确定2-酮丁酸的量。酶活单位定义为在22℃下，每分钟形成1 mol 2-酮丁酸的量；比酶活定义为每毫克蛋白每分钟生成氨基脲衍生物的μmol数。试验重复测定3次。

1.6.2 AHAS酶活检测

AHAS酶活测定参考文献[5]，酶反应体系为1 mL：100 mmol/L的2-酮丁酸，100 mmol/L的丙酮酸钠，10 mmol/L的MgCl2，0.2 mmol/L的焦磷酸硫胺素及100 mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH 7.8）。随后加入一定体积纯酶液，37℃孵育1 h后加入100 μL 3 mol/L H2SO4终止酶反应，该反应混合物12 000 r/min离心15 min，取上清液于干净的EP管中65℃孵育15 min。然后加入1 mL 0.5%的肌酸，1 mL 5%的α-萘酚溶液（2.5 mol/L NaOH新鲜配制），65℃孵育20 min，冷却至室温。525 nm处测定反应产物的吸光度值，产物3-羟基-2-丁酮由标样定量。酶活单位定义为37℃下每分钟形成1 mol 3-羟基-2-丁酮所需的酶量，比酶活定义为每毫克蛋白每分钟生成3-羟基-2-丁酮的量。试验重复3次。

1.6.3 TD及AHAS对支链氨基酸的抗反馈抑制性

TD的抗反馈抑制性：将L-异亮氨酸加入TD酶学反应体系中，终浓度为0，0.3，0.6，1.2，4.5，18.4和50 mmol/L，测定不同浓度下的酶活。相对酶活定义为不同浓度L-异亮氨酸存在下的比酶活与初始酶活的百分比。

AHAS的抗反馈抑制性：L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸加入酶学反应体系中的方式有两种：1）单个加入，终浓度分别为0，2，4，6，8和10 mmol/L；2）两两组合或三个组合加入。相对酶活定义为支链氨基酸添加下比酶活与初始比酶活的百分比。

2 结果与分析

2.1 目标蛋白表达载体构建

根据C.glutamicum ATCC 13032[6]全基因组测序序列设计引物，既根据C.glutamicum ATCC 13032基因组中ilvA及ilvBN基因的上下游序列分别设计PCR引物（ilvA-F，ilvA-R，ilvBN-F，ilvBN-R）。选C.glutamicum ATCC 13869和C. glutamicum JHI3-156基因组为PCR扩增模板。基因ilvA及ilvA1用引物ilvA-F及ilvA-R进行扩增；基因ilvBN及ilvBN1用引物ilvBN-F及ilvBN-R进行扩增；四个PCR扩增产物用EcoRI及HindIII双酶切，连接到相同酶酶切且携带组氨酸标签的pET28a载体上，后转化至E.coli DH5α感受态细胞中。经HindIII单酶切和PCR验证，表明这四个重组质粒构建成功形成重组质粒：pET28a-ilvA，pET28a-ilvA1，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1。图2为蛋白表达载体构建框架图。

图3为重组质粒单酶切及目标基因PCR产物核酸电泳验证结果。ilvA和ilvA1经PCR扩增后的基因片段约1 311 bp，pET28a-ilvA，pET28ailvA1经HindIII酶切后的片段长度约6 680 bp；同时ilvBN和ilvBN1经PCR扩增后的基因片段约2 413 bp，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1经HindIII酶切后的片段长度约7 782 bp，表明重组质粒pET28a-ilvA，pET28a-ilvA1，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1在E.coli DH5α中构建成功。蛋白表达菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-ilvA，E.coli BL21(DE3)/pET28a-ilvA1，E.coli BL21(DE3)/ pET28a-ilvBN及E.coli BL21(DE3)/pET28ailvBN1的获得需将pET28a-ilvA，pET28a-ilvA1，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1四个重组菌转化到感受态细胞E.coli BL21（DE3）中，经卡那霉素筛选及HindIII单酶切和PCR验证后确认获得上述蛋白表达菌。

2.2 基因突变点的检出

来自于菌株C.glutmicum JHI3-156的基因ilvA1与来自于野生菌株C.glutmicum ATCC 13869的基因ilvA相比，前者显示有一个突变位点T1147G，使得TD的383号氨基酸处有一F383V氨基酸替换。来自于菌株C.glutmicum JHI3-156的基因ilvBN1与来自于野生菌株C. glutmicum ATCC 13869的基因ilvBN相比，前者显示有三个突变位点，分别为C526T，C1278G和T1724G，使得AHAS的大亚基上的三个氨基酸突变，分别为P176S，D426E和L575W。该L-异亮氨酸有效生产菌种中TD及AHAS两个关键酶突变位点的发现对L-异亮氨酸高产起到重要作用。

2.3 SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况

重组菌BL21（DE3）/pET28a-ilvA和BL21（DE3）/pET28a-ilvA1相比对照菌，两者均有一条特异性蛋白条带，分子量均为43 kDa，与TD的理论分子量大小基本一致。同理分析重组菌BL21（DE3）pET28a-ilvBN及BL21（DE3）/pET28ailvBN1均有两条66 kDa和18 kDa的特异性蛋白条带，基本与AHAS大小亚基的理论分子量一致。从而分析得出野生型和突变型的TD及AHAS在载体表达菌E.coli中表达很好。由于注意到在E.coli BL21（DE3）中表达的苏氨酸脱水酶与乙酰羟合酶氨基酸序列N末端的6×His标签，所以选用Ni-NTA进行蛋白纯化。

2.4 突变型TD及AHAS的抗反馈抑制能力分析

考虑到胞内物质对酶活测定的干扰性，重组菌细胞经IPTG诱导表达后超声波破碎，并离心取上清液，利用Ni-NTA纯化后获得目标蛋白。实验结果显示（图5）：BL21（DE3）/pET28a-ilvA重组菌中野生型TD酶活会随着L-异亮氨酸浓度的增加而降低，当异亮氨酸的浓度达到1.2 mmol/L时，野生型TD酶活降低至15%。说明TD酶活受到L-异亮氨酸的严重抑制，表明野生型TD仍受L-异亮氨酸的反馈抑制，无抗反馈抑制能力。而BL21（DE3）/pET28a-ilvA1重组菌中突变型TD酶活不但不会受L-异亮氨酸抑制，反而增加突变型TD酶活。当异亮氨酸浓度达到0.3 mmol/L时，突变型TD酶活增加5倍，当L-异亮氨酸浓度逐渐增高时，该蛋白的比酶活迅速下降，但即使L-异亮氨酸浓度为50 mmol/L时，突变型TD酶活仍未受到L-异亮氨酸的反馈抑制。结果表明L-异亮氨酸不仅不会抑制突变型TD比酶活，反而激活了该酶活性，表明突变型TD具有抗反馈抑制能力。

实验结果显示（图6）：重组菌BL21（DE3）/ pET28a-BN及BL21（DE3）/pET28a-BN1中野生型和突变型AHAS酶仍然受到三支链氨基酸的反馈抑制，因随着支链氨基酸L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-亮氨酸的单独添加及其组合添加，野生型和突变型AHAS酶活均下降。但突变型AHAS体现出与野生型AHAS不一样的抑制程度，尤其表现出对异L-亮氨酸、L-缬氨酸及支链氨基酸任意两两组合或三个组合的更多耐受性。

3 结论

通过对L-异亮氨生产菌C.glutamicum JHI3-156中突变酶TD1及AHAS1初步研究得出，L-异亮氨酸激活了突变型TD1的酶活，TD1不再受L-异亮氨酸抑制，表现出对L-异亮氨酸的抗反馈抑制能力；突变型AHAS1酶活仍受支链氨基酸的反馈抑制，但表现出对较高浓度L-异亮氨酸的耐受性。本研究可为后续生产中提高L-异亮氨酸产量提供参考。

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（责任编辑：朱小惠）

表3 连续运行物料平衡分析

5 结论

利用卧螺离心机可实现色氨酸陶瓷膜浓液的二次回收，进一步提高色氨酸成品收率。根据中试实验结果，可以回收色氨酸陶瓷膜浓缩液中53%的色氨酸，成品收率在原有基础上提高2%，同时各项成品单耗降低。每吨色氨酸成本下降约420元。同时，菌体经提纯后，蛋白饲料产品品质会有所提升。但目前该工艺对卧螺离心机转速、进料量要求较高，工艺设备投资回报率较长，后续需要作进一步的设备选型及工艺优化、调整，以期获得更大的利润。

参考文献：

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[5]梅丛笑.L-色氨酸提取工艺的研究[D].天津:天津轻工业学院,2000.

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（责任编辑：朱小惠）

A primary research of mutant TD1 and AHAS1 in L-isoleucine producing strain Corynebacterium glutamicum JHI3-156

WU Jinrong1,LI Xijun1,LIU Shizhou2,BO Wengweng2,WANG Yujie2
(1.Xinjiang Fufeng Biotechnology Co.,Ltd.,Urumqi 830000,China; 2.Shandong Fufeng Fermentation Co.,Ltd.,Linyi 276600,China)

Threonine dehydratese(TD)and acetohydroxy acid synthase(AHAS)are key enzymes involved in L-isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.TD is inhibited by the feedback of L-isoleucine,and AHAS is inhibited by the feedback of three branched-chain amino acids.The investigation of TD1 and AHAS1 mutants in L-isoleucine producing strain Corynebacterium glutamicum JHI3-156 found that TD1 has one mutant amino acid,while AHAS1 has three mutant amino acids.TD,TD1,AHAS and AHAS1 were all over-expressed in Escherichia coli BL21(DE3)and purified for enzyme activity determination.The results showed that the mutant TD1 exhibited higher activity compared with the wild type TD and it was completely resistant to L-isoleucine.Compared with the wild type AHAS,the mutant AHAS1 was more resistant to higher concentration of L-isoleucine.

mutant TD1;mutant AHAS1;enzymatic activity determination;L-isoleucine;antifeedback inhibition

Q814

A

1674-2214（2016）04-0240-08

2016-09-22

吴锦荣（1985—），女，新疆博尔塔拉人，助理工程师，硕士，主要从事分子生物学方面的研究,E-mail:850640619@qq.com.