醇脱氢酶不对称还原2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯

余道福，张晓健，黄建峰，陈翔，柳志强

(1.浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014；

2.浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江杭州310014)

醇脱氢酶不对称还原2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯

余道福1,2，张晓健1,2，黄建峰1,2，陈翔1,2，柳志强1,2

(1.浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014；

2.浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江杭州310014)

孟鲁司特钠是主要的抗哮喘药物之一，2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯是孟鲁斯特钠的关键手性砌块。以实验室筛选到的醇脱氢酶不对称还原2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯，制备2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯。在辅酶添加量为0.1 g/L，底物浓度为219.3 mmol/L，菌体用量为30 g/L，pH 7.5，45℃反应7 h后，底物转化率达到100%，时空产率为31.2 mmol/(L·h)，产物e.e.值大于99.9%。通过分批补料，反应5 h，底物转化率达到100%，e.e.＞99.9%，时空产率达43.7 mmol/(L·h)，是一次性投料的1.4倍。

醇脱氢酶；孟鲁司特钠；不对称还原

孟鲁斯特钠（Montelukast Sodium），化学名为[R-(E)]-1-[[[1-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-[2-(1-羟基-1-甲基乙基)苯基]丙基]硫代]甲基]环丙基乙酸钠（结构式如右图），是目前主要的抗哮喘药物之一，由Merk公司研制[1]。孟鲁斯特钠作为一种白三烯受体拮抗剂，对I型半胱氨酰白三烯（CysLT）受体具有高度的亲和性和选择性，能有效抑制半胱氨酰白三烯（LTC，LTD，LTE）与CysLT受体结合所产生的生理效应而无任何受体激动活性[2]。2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯（(S)-2）是孟鲁斯特钠的关键手性中间体，作为该药物的主体结构，其高效合成方法的研究一直是孟鲁斯特钠合成的研究热点。该中间体的合成分为化学法和酶法合成两类方法。化学合成孟鲁斯特钠最初由Merck Frosst Canada Inc.开发，并申请了多个相关专利[3-5]，关键反应步骤是通过手性试剂还原得到手性中间体醇[6-7]。在手性还原试剂的作用下，底物的转化率和产物的对映体选择性均可满足工业化生产的需求。但是，该类型反应条件苛刻，需高温高压、氮气保护、极度低温等系列操作条件，一定程度上限制了工业化应用[8-9]。Zhu等[10]报道的以Ir/SpiroPAP作为手性催化剂进行手性中间体醇的合成，其反应条件较为温和，单位底物的催化剂添加量较低。但该方法转化率只有90%～95%，且副产物较多，另外要求在高压及完全干燥的环境下进行。

以醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH，EC 1.1.1.1）为催化剂，进行关键中间体的合成首先由Roberge等报道，如下图所示。利用Microbacterium sp.MB 5614中的醇脱氢酶催化底物酮生成S构型的醇，e.e.值达到了95%，且酶法催化具有反应条件温和、环境友好以及原子利用率高等优势[11-12]。底物酮1在水相中几乎不溶，需要选择合适的有机溶剂进行溶解[13]，而生物酶在有机溶剂中活力低、稳定性差[14]，制约了酶的工业化应用。筛选对有机溶剂耐受性强、酶活力高和稳定性好的生物催化剂具有重要的工业应用价值。笔者利用实验室已构建的氧化还原酶酶库，筛选获得一株产醇脱氢酶菌株E.coli BL21/ pET 28b-ADH，并对其催化合成(S)-2的反应条件进行了考察。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

菌株Escherichia coli BL21/pET28b-ADH（实验室编号：ZJB14004），由本实验室构建并保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂糖20 g/L，pH 7.0，121℃灭菌20 min后补加卡那霉素至最终质量浓度为50 μg/mL。

种子培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，121℃灭菌20 min后补加卡那霉素至最终质量浓度为50 μg/mL。

发酵培养基：胰蛋白胨15 g/L，酵母粉12 g/L，NaCl 10 g/L，(NH4)2SO45 g/L，甘油15 g/L，KH2PO41.36 g/L，K2HPO4·3H2O 2.28 g/L，MgSO4· 7H2O 0.375 g/L，pH 7.0，灭菌后补加卡那霉素至最终质量浓度为50 μg/mL。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体培养方法

种子液培养：将甘油管保藏的菌种进行卡那抗性平板划线活化培养，37℃培养12 h后用接种环挑取单菌落至卡那抗性斜面活化。用接种环挑取1接种环菌接入装有50 mL种子培养基的250 mL三角烧瓶中，150 r/min，37℃培养8 h，至OD600为4.5～5.0时用作种子液。

发酵培养：吸取2 mL种子液接种于装有100 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中，150 r/min，37℃培养至菌液OD600为0.4～0.6时加入乳糖进行诱导，诱导剂最终质量浓度为10 g/L，于150 r/min，28℃下诱导11 h。

1.2.2 酶促催化反应

静息细胞制备：诱导结束后，发酵液在8 000 r/min，4℃条件下离心10 min，收集菌体细胞，用9%的生理盐水洗涤菌体2次，离心弃上清后保存于-20℃冰箱中备用。

催化反应过程：催化反应体系10 mL，异丙醇5 mL，三乙醇胺缓冲液（100 mmol/L，pH 7.0）4 mL，甲苯1 mL，NADP+0.1 g/L，醇脱氢酶质量浓度为30 g/L。加入219.3 mmol/L底物后，500 r/min，40℃磁力搅拌转化。

样品处理方法：取50 μL转化液加到50 μL四氢呋喃中终止反应，溶解其中的产物和底物，离心后上清用流动相稀释300倍，经0.22 μm有机膜过滤后进行高效液相检测。

1.2.3 分析方法

底物、产物采用高效液相色谱分析。色谱柱使用Chiracel OD-H正相柱（250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相V（正己烷）∶V（异丙醇）=80∶20，流速1.0 mL/min，紫外检测波长287 nm，进样量20 μL，柱温40℃。

产物的e.e.值按如下公式计算

式中：A（S）表示S构型产物的峰面积，A（R）表示R构型产物的峰面积。

底物的转化率η按如下公式计算

式中：C0表示起始底物浓度，g/mL；C表示反应后底物浓度，g/mL；V表示反应体系体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 辅酶依赖类型的确定

醇脱氢酶在进行催化反应时，需辅酶参与，不同来源的醇脱氢酶所需辅酶类型也不相同。添加不同类型辅酶，检测反应最终的转化率及e.e.值，对该酶的辅酶依赖类型进行考察。该酶在添加NADP+时，转化率为99.7%，明显高于添加NAD+时的转化率（90.4%）。可以确定该细胞中存在内源性的辅酶，而且该酶是以NADPH作为氢供体进行催化还原反应。另外，不同类型辅酶添加不影响e.e.值（均大于99.9%）。

2.2 辅酶浓度对催化反应的影响

实验进一步研究了辅酶的浓度对该酶催化不对称还原反应的影响，结果如图1所示。在不添加辅酶的情况下，反应24 h，底物转化率为95.9%，底物不能完全转化；随着辅酶质量浓度从0 g/L升高到0.1 g/L，底物转化率升高到99.6%，表明内源性辅酶并不能满足不对称还原反应的需要，需要添加外源性辅酶以维持反应继续进行；在此基础上，继续增加辅酶质量浓度，底物转化率没有明显的提高，因此确定该反应需添加外源性辅酶，添加量为0.1 g/L。

2.3 催化剂形式对催化反应的影响

实验考察了菌体用量为30 g/L时，细胞破碎液与全细胞两种催化剂形式对催化反应的影响，结果如图2所示。采用细胞破碎液催化和采用全细胞作为催化剂，二者最终的转化率均为96%；以细胞破碎液为催化剂，在17 h底物转化率达到最大值，全细胞则需要24 h。考虑综合成本，本实验采用全细胞进行催化。

2.4 催化反应有机相种类与比例的确定

为提高底物的溶解性，实验考察了13种常用有机溶剂，添加的体积分数为10%，结果如表1所示。底物在以甲苯、二甲苯和间二甲苯作为助溶剂的反应体系中，转化率最高，达98%左右；以其他类型的有机溶剂作为助溶剂，底物转化率均低于90%。对转化率和lg P值综合分析可知，随着有机溶剂lg P值的升高，转化率呈现增高的趋势，推测随着lg P值的增高，有机溶剂在水相中的分配比例降低，对酶的抑制作用减小，转化率增加。综合考虑经济性及催化效率，选择甲苯作为助溶剂进行催化反应。另外，实验室所选择的13种有机溶剂，产物e.e.值均大于99.9%，说明有机溶剂对于酶的立体选择性没有影响。

表1 两相体系催化合成(S)-1中有机溶剂的筛选

在两相体系反应中，底物和产物主要溶于有机相，酶则存在于水相。实验考察了甲苯的添加比例对催化反应的影响。当甲苯的体积分数为5%～15%时，底物转化率可达99.5%以上；甲苯的体积分数为5%时，底物的转化率达到最大值99.8%；当甲苯的体积分数大于15%后，继续增加甲苯的体积分数，底物转化率迅速下降。说明有机溶剂的比例过高，会严重降低酶的活力。

2.5 转化温度对催化反应的影响

实验考察了转化温度对不对称还原效率的影响，结果如图3所示。当转化温度在25～35℃时，随着温度的升高，底物转化率由84%升高到97%；当转化温度在35～45℃时，转化率在97%左右；当温度继续升高至50℃以上时，转化率迅速下降。进一步对35，40，45℃下的反应进程进行研究（图4），当转化温度在45℃时，反应速度最快，5 h达到平衡。因此选择45℃作为最优反应温度。

2.6 pH对催化反应的影响

实验考察了pH为6.5～8.9时对催化反应的影响，结果如图5所示。当pH由6.5升高到7.5时，底物转化率逐渐升高；当pH为7.5时，转化率达到最大值97.6%；当pH高于7.5时，底物转化率明显下降。pH对酶的立体选择性没有影响，e.e.值始终保持在99.9%以上。因此选择pH 7.5为最适反应pH。

2.7 金属离子种类与浓度对催化反应的影响

实验考察了不同种类、不同浓度的金属离子对酶催化反应的影响，结果如表2所示。金属离子对酶的立体选择性没有任何影响，e.e.值均在99.9%以上。不同金属离子在不同浓度下对酶催化反应的转化率影响较大。在体系中分别添加1 mmol/L的Co2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，K+等金属离子，底物的转化率保持在99.5%以上，而Fe3+，Zn2+和Mn2+对酶活具有明显的抑制作用，底物转化率分别只有77.4%，56.8%和40.6%；当金属离子添加浓度为10 mmol/L时，Ca2+，Mg2+，Ba2+，K+的底物转化率保持在99.4%以上，说明Ca2+，Mg2+，Ba2+，K+具有提高该酶催化活性的作用；而其余的金属离子对酶催化反应都有明显的抑制作用，添加Fe3+，Fe2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+后，几乎检测不到产物，说明以上金属离子对酶有很强的抑制作用。

2.8 分批补料对催化反应的影响

考虑到反应体系中可能存在底物抑制，实验进行了分批补料催化的研究。在初始底物浓度为65.5 mmol/L的反应体系中，于反应80，160 min时分别加入65.5和87.3 mmol/L底物，对反应进程进行测定，结果如图6所示。反应5 h，转化率达到100%，产物产量218.3 mmol/L，e.e.＞99.9%，时空产率为43.7 mmol/(L·h)，高于一次性投料转化的水平（31.2 mmol/(L·h)，图7）。

表2 金属离子对不对称还原反应的影响

在补料反应的基础上增加了每次添加的底物浓度，反应初始底物浓度为87.3 mmol/L，反应100，200 min时分别向体系中加入87.3 mmol/L的底物，对反应进程进行测定，结果如图8所示。反应320 min时，底物添加量累积达到263.2 mmol/ L，产物产量达到261.9 mmol/L，单位菌体时空产率为1.64 mmol/(L·h)，高于已有报道水平[13]；在320 min继续添加87.3 mmol/L底物后，底物不能完全转化，说明酶已部分失活或存在产物抑制作用。

3 结论

笔者利用实验室筛选的醇脱氢酶产生菌株E.coli BL21/pET 28b-ADH（本实验室保藏，编号为ZJB14004）不对称还原底物酮1，制备关键手性中间体醇(S)-2。在菌体用量30 g/L，底物浓度219.3 mmol/L的条件下，确定最了适反应条件。在最优条件下，反应7 h后底物转化率达到100%，时空产率31.2 mmol/(L·h)，产物e.e.值大于99.9%。分批补料研究表明：分两批补料，反应5 h，转化率达到100%，产物生成量为218.3 mmol/L， e.e.＞99.9%，时空产率为43.7 mmol/(L·h)，是一次性投料的1.4倍。本研究为孟鲁司特钠关键手性中间体(S)-2制备提供了一种高效低成本的绿色生物合成方法，具有较高的工业应用价值。

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（责任编辑：朱小惠）

Asymmetric reduction of methyl 2-[3-[3-(2-(7-chloro-2-quinolinyl) ethenylphenyl]-3-oxopropyl]benzoate by alcohol dehydrogenase

YU Daofu1，2,ZHANG Xiaojian1，2,HUANG Jianfeng1，2,CHEN Xiang1，2,LIU Zhiqiang1，2
(1.College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China；
2.Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province，Hangzhou 310014，China)

Montelukast sodium is one of the main anti-asthmatic drugs.Methyl[E]-2-[3-(S)-[3-[2-(7-chloro-2-quinolinyl)ethenyl]phenyl]-3-hydroxypropyl]benzoate is the key chiral block for the synthesis of montelukast sodium.The alcohol dehydrogenase screened previously in our lab was used for the asymmetric reduction of methyl 2-[3-[3-(2-(7-chloro-2-quinolinyl)ethenyl] phenyl]-3-oxopropyl)benzoate to produce methyl[E]-2-[3-(S)-[3-[2-(7-chloro-2-quinolinyl) ethenyl]phenyl]-3-hydroxypropyl]benzoate.Under the conditions of coenzyme 0.1 g/L,substrate concentration 219.3 mmol/L,cell loading 30 g/L,pH 7.5 and 45℃,the substrate was converted completely in 7 h with the space time yield of 31.2 mmol/(L·h),and e.e.of 99.9%.The fed-batch asymmetric reduction mode increased the space time yield to 43.7 mmol/(L·h),with a final conversion of 100%,and e.e.value of 99.9%.

alcohol dehydrogenase;montelukast sodium;asymmetric reduction

Q599

A

1674-2214（2016）04-0220-06

2016-05-12

余道福（1990—），男，浙江杭州人，硕士，研究方向为生物酶催化，E-mail：1007022623@qq.com.通信作者：柳志强教授，E-mail:microliu@zjut.edu.cn.