GABA产生菌的筛选以及检测方法的比较研究

刘梦云，申雨珂，靳羽晓，吴元锋,2，龚金炎,2，楼坚,2，毛建卫,2,3，刘士旺,2,3

(1.浙江科技学院生化学院/轻工学院，浙江杭州310023；

2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023；

3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江杭州310023)

GABA产生菌的筛选以及检测方法的比较研究

刘梦云1，申雨珂1，靳羽晓1，吴元锋1,2，龚金炎1,2，楼坚1,2，毛建卫1,2,3，刘士旺1,2,3

(1.浙江科技学院生化学院/轻工学院，浙江杭州310023；

2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023；

3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江杭州310023)

对发酵产GABA的乳酸菌进行了筛选以及对GABA检测方法进行了比较。从市售酸奶中分离到一株产GABA的乳酸菌，经形态学和生理生化鉴定，初步确认为德氏乳杆菌；探索了两种不同GABA检测方法的效果。比色法测定GABA含量的条件为体积分数2%的饱和苯酚和质量分数2.08%的次氯酸钠处理，纸层析-分光光度法测定GABA含量的最适条件为：展开剂V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）＝4∶1∶3，显色温度80℃，显色时间30 min，检测波长510 nm。

γ-氨基丁酸；德氏乳杆菌；GABA检测

已有许多研究者对乳酸菌发酵进行了研究，并取得了很好的研究结果，其中乳酸菌在生长过程中产生γ-氨基丁酸（GABA）越来越引起人们的关注[1-4]。研究发现，GABA具有提高动物的记忆、增强免疫力、降低血压、保护肾脏、预防肥胖和抗焦虑等功效，特别是GABA可以提高葡萄糖磷酸酯酶的活性，使脑细胞活动旺盛，可促进脑组织的新陈代谢和恢复脑细胞功能，改善神经机能，对脑血管障碍引起的症状，如偏瘫、记忆障碍、儿童智力发育迟缓及精神幼稚症等有很好的疗效，该领域已经成为研究热点之一[5-8]。

笔者对分离得到的乳酸菌进行了形态学观察和生理生化鉴定，筛选能够产生GABA的乳酸菌，对GABA的实验室检测方法作了比较，为开发利益乳酸菌资源提供了技术指导。

1 实验材料

1.1 供试菌种

实验室分离乳杆菌（德氏乳杆菌）。

1.2 培养基

MRS培养基：牛肉膏10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠2 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，加入15～20 g琼脂制成MRS固体培养基，pH 6.2～6.4，121℃灭菌20 min。

乳酸菌发酵培养基：酵母膏5 g，糙米酶解液（5 g糙米酶解）5 g，番茄汁100 mL，L-谷氨酸10 g，蒸馏水900 mL，pH 6.4，121℃灭菌20 min。

2 实验方法

2.1 乳酸菌分离与鉴定

2.1.1 乳酸菌分离

将市售新鲜双峰酸奶稀释到10-5，涂布在MRS固体培养基上，37℃培养3 d后挑取单菌落，划线接种得到纯化菌株。挑取纯化菌株到MRS试管斜面上，用硅胶塞塞好试管口，保藏在4℃冰箱，每两周转接一次。

2.1.2 乳酸菌鉴定

1）乳酸菌形态学观察

将保藏在4℃冰箱里的试管斜面取出，在试管斜面上划线2～3次，使其充分活化。将活化好的菌在MRS液体培养基上培养16 h，再取发酵液稀释到适当浓度，涂布在MRS固体培养基上，37℃培养3 d观察菌落形态、大小、颜色、是否褶皱等特征。挑取培养3 d的单菌落，革兰氏染色，观察细胞形态、染色情况、排列方式等，并拍照记录。

2）接触酶检测

将培养24 h的斜面菌种用灭菌玻璃棒或灭菌牙签挑取一小环，涂抹于滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。

3）糖发酵试验

蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，吐温-80 0.5 mL，糖或醇10 g，蒸馏水1 000 mL，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1.4～2 mL，调pH 6.8～7.2，分装于试管，分装好的培养基112℃灭菌30 min，接种后轻摇试管，37℃培养1～2 d。产酸时，溴甲酚紫由紫色变为黄色，为阳性，不变色或变蓝（紫）为阴性。灭菌时用棉塞，培养时用橡胶塞。

4）淀粉水解试验

固体淀粉培养基：蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉膏5 g，可溶性淀粉2 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂15～20 g，121℃灭菌20 min。制成平板，划线接种，37℃培养1 d，观察菌生长情况，滴入少量卢戈氏碘液，使碘液充满整个平板。如果菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，为阳性。

5）油脂水解试验

油脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，香油或花生油10 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，调pH为7.2，加1.6%中性红水溶液1 mL，分装时，需不断搅拌，使油脂均匀分布于培养基，121℃灭菌20 min。制成平板，划线接种，37℃培养1 d，如果出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。

6）明胶水解试验

明胶培养基：牛肉膏蛋白胨液100 mL，明胶12～18 g，在水浴锅将上述成分融化，融化后调节pH 7.2～7.4，分装到试管，121℃灭菌30 min。穿刺接种后20℃培养2～5 d，观察明胶液化情况。

7）甲基红试验

葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氢二钾2 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2，双层纱布过滤，分装试管，每管10 mL，112℃灭菌30 min。接种后37℃培养48 h，加入甲基红试剂2滴，培养基变红者为阳性，变黄为阴性[3]。

8）V.P.试验

培养基同葡萄糖蛋白胨水培养基。接种后37℃培养48 h，加入5～10滴40%的NaOH，然后加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15～30 min，培养物为红色者为阳性反应[3-4]。

2.1.3 产GABA乳酸菌的初步筛选

将得到的纯化菌株接种于含10 g/L L-谷氨酸的MRS液体培养基中，37℃静置发酵2 d后，取发酵液10 000 r/min离心5 min后点样，在V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3的展开剂中展开。放入80℃烘箱中干燥30 min，取出观察结果。

2.1.4 纸层析—分光光度法测定GABA

分别选择V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）为2∶1∶1，4∶1∶3，4∶1∶1试验不同配比展开剂对GABA层析效果的影响。将滤纸按照层析缸大小进行裁剪，所用层析缸为20 cm×20 cm，故滤纸高度15～20 cm，宽度按要点的样品个数选择适当长度。在展开剂中加茚三酮4 g/L，平衡约30 min，再用毛细管分别点上10 g/L L-谷氨酸，1 g/L GABA，发酵液（3 d，含10 g/L L-谷氨酸的MRS培养基）10 000 r/ min离心5 min后点样，层析结束后，在90℃烘箱显色15 min，取出观察显色斑点。点样过程注意保持滤纸干燥洁净，以免污染滤纸使结果有误差；取出观察显色斑点时，要注意开烘箱的一瞬间，烘箱中正丁醇和醋酸挥发气体对眼睛和呼吸道的影响。

2.1.5 洗脱液最佳吸收波长的测定

用微样进量器吸取GABA标准液1 μL点样（GABA标准液为20 mg/mL，即点样GABA为20 μg），展开剂配比为V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，加入茚三酮4 g/L。90℃干燥15 min，剪下标准液斑点放入玻璃试管中，加入5 mL洗脱液（V（0.1%硫酸铜）∶V（75%乙醇）=2∶38）洗脱30 min后，分别在490，500，505，510，513，515，520，525，535 nm处测吸光度，空白液为洗脱液。

2.1.6 显色温度和时间的确定

用微样进量器吸取GABA标准液1 μL点样（GABA标准液为20 mg/mL，即点样GABA为20 μg），展开剂配比为V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，加入茚三酮4 g/L。层析结束后，分别在70，80，90℃下显色10，20，30，40 min，剪下显色斑点洗脱比色测定OD510。

2.1.7 GABA标准曲线的制作

用微样进量器分别吸取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL的GABA标准液5 μL，点样，在展开剂配比为V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，茚三酮4 g/L的展开剂中层析分离。层析结束后，立即放入80℃烘箱干燥显色30 min取出，在V（0.1%硫酸铜）∶V（75%乙醇）=2∶38的洗脱剂中洗脱30 min，测定洗脱液的OD510。

2.1.8 乳酸菌产GABA的定性测定

将得到的纯化菌株接种于含10 g/L的L-谷氨酸的MRS液体培养基，37℃静置发酵2 d后，取发酵液10 000 r/min离心5 min后点样，在V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3的展开剂中展开。放入80℃烘箱中干燥30 min，取出观察结果。

3 结果与分析

3.1 乳酸菌形态学观察

实验结果如图1所示：通过显微镜观察和形态学观察，乳酸菌菌落长的较小，乳白色，较湿润，直径1.5 mm左右，中间隆起，不透明，边缘不平整。革兰氏染色镜检发现此乳酸菌为G+、杆状菌。

3.2 乳酸菌生理生化结果

乳酸菌的生理生化实验结果如表1所示，查阅孟祥晨[3]等编著的《乳酸菌与乳品发酵剂》，得知此菌为德氏乳杆菌。

表1 乳酸菌生理生化结果1）

3.3 产GABA乳酸菌筛选

对4种菌株培养基发酵液分别做纸层析，编号分别为3，4，5，6，点1为GABA标准样品，点2为L-谷氨酸标准样品，实验结果如图2所示。

3号培养基乳酸菌数多，但5号培养基里GABA跑出的点颜色比其余3点深，GABA产量也最高，故选择3号菌株为发酵菌株。乳酸菌经加有10 g/L L-谷氨酸的MRS液体培养基发酵后，能产GABA。

3.4 GABA检测方法比较

3.4.1 GABA标准曲线的制作

由图3得知：线性回归方程为y=0.167 6x+ 0.003 1，R2=0.994 8，具有较好的精确度。

3.4.2 比色法测定GABA

比色法是利用苯酚、次氯酸钠与游离氨反应呈蓝色来测定不同体系中的微量氨及其盐类的含量，即Berthelot反应。氨基酸存在氨基，对Berthelot反应存在一定的响应。氨基酸中氨基的位置不同，对Berthelot反应的响应程度也不同。其中ω-氨基酸反应灵敏度最高，而α-氨基酸响应低，因此可用来测定ω-氨基酸的含量。

通常GABA浓度越高，反应后溶液呈现的蓝色越深。由于Berthelot反应中苯酚和次氯酸钠对比色结果有影响，因此首先对其浓度进行确定。

从图4中可以得知：随着苯酚体积分数的升高，OD值也升高，在苯酚体积分数为2%时OD值最高，苯酚体积分数再升高时，OD值反而下降，所以比色法测定GABA的最适苯酚体积分数为2%。

从图5中可以得知：随着次氯酸钠质量分数的升高，OD值也升高，次氯酸钠质量分数为2.08%时OD达到最高值，次氯酸钠质量分数再往上升高，则OD值下降较快，所以比色法测定GABA的最适次氯酸钠质量分数为2.08%。

由图6可知：该曲线具有较好的线性关系，但在测定糙米及发酵液GABA含量时，发现离心后的溶液仍带点混浊，对测量造成很大误差，测量后发现每100 g糙米GABA含量为文献数据[27]的10～20倍，准确性差。

该方法适用于大量样品检测，但容易受到溶液中游离氨的影响。比色法适用于米胚芽和谷氨酸脱羧酶转化体系中的GABA质量浓度检测，但要考虑L-谷氨酸对检测的影响。在检测时，苯酚和次氯酸钠用量对结果有关键影响，起初吸光度都随苯酚和次氯酸钠用量增加而增加，达到一定量后，吸光度反而下降，而且高浓度用量对低浓度GABA检测极为不利，所以选择正确苯酚和次氯酸钠用量对实验结果有很大影响。

3.4.3 纸层析-分光光度法测定GABA

纸层析是在一张特制的滤纸如新华1号层析纸上，在距滤纸底部1～2 cm处画上一条直线，在直线上相距2 cm左右用铅笔各点上一个点，用毛细吸管或微样进量器在点上滴上要测定的样品液，然后用特定展开剂（加茚三酮）展开，使样品中各个物质分开。当展开剂前沿到达距滤纸顶端1～2 cm时，立即将滤纸放入一定温度的烘箱，滤纸平铺在干燥洁净的平板上，干燥一定时间后显色，将显色斑点剪下，吸取一定量洗脱剂洗脱，测定洗脱液吸光度，从而计算样品GABA质量浓度。

1）展开剂不同配比对GABA层析效果的影响

从左到右的点分别是1 g/L GABA，10 g/L L-谷氨酸，含10 g/L L-谷氨酸的MRS培养基，展开剂A的配比为V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=2∶1∶1（图7（a））；展开剂B的配比为V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶1（图7（b））；展开剂C的配比为V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3（（图7（c））。图7（c）的第四个点是含10 g/L L-谷氨酸的MRS培养基的点。由图7（c）得知展开剂体积比为4∶1∶3展开时，发酵液GABA和L-谷氨酸分离较好，故选择展开剂配比为4∶1∶3。

2）洗脱液最佳吸收波长的测定

由图8得知：随着吸收波长的增加，OD值也在增加，OD值在510 nm处达到最大值，继续增大吸收波长，OD值反而下降。在510 nm处，GABA洗脱液的OD值最大，对GABA浓度测定误差最小，故测量GABA浓度选择波长为510 nm。

3）显色温度和时间的确定

由表2得知：随着温度的升高和显色时间的延长，GABA洗脱液OD值下降；显色温度太高，会造成GABA与茚三酮的反应物与层析纸结合牢固，不能被洗脱下来在洗脱液中形成铜的络合物[17]；显色时间过长，虽然OD值上升，但时间久，络合物可能分解造成OD值下降。综合上述分析选择显色温度和时间分别为80℃、30 min。

表2 显色温度和时间对吸光度影响

4 结论

本次实验乳酸菌菌种是从酸奶中分离出的一类有益微生物，该菌在自然界中广泛存在并且得到了有效利用，不同研究者对乳酸菌的形态、生理、代谢等进行了研究，力求最大限度利用和开发乳酸菌资源，使乳酸菌造福于人类[9-12]。高产GABA乳酸菌的分离，为人们利用乳酸菌创造了新的途径，笔者建立的GABA检测方法，可以有效帮助分离GABA乳酸菌和筛选高含量GABA菌株，从实验结果来看，苯酚体积分数2%、氯酸钠质量分数2.08%有利于比色法测定GABA，展开剂体积比4∶1∶3，显色温度80℃，显色时间30 min的纸层析-分光光度法能够较好测定GABA。下一步还可以从干燥温度、干燥时间、洗脱波长、洗脱液量、展开剂配比等方面进行条件优化，尤其是展开剂配比应针对发酵液而设计，还可以尝试硅胶板代替滤纸做层析，获得更加有效的GABA检测方法。

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（责任编辑：朱小惠）

Isolation of high-GABA production strains and comparison of GABA assay methods

LIU Mengyun1,SHEN Yuke1,JIN Yuxiao1,WU Yuanfeng1,2,GONG Jinyan1,2,LOU Jian1,2, MAO Jianwei1,2,3,LIU Shiwang1,2,3
(1.School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry,Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023,China;2.Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Product,Hangzhou 310023,China;3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing,Hangzhou 310023,China)

The GABA producing Lactobacillus was isolated and the GABA assay methods were compared in this paper.A GABA producing strain was isolated from yoghurt,which was identified as Lactobacillus delbruckii by morphological,physiological and biochemical characterization.The optimum concentrations of phenol and sodium hypochlorite for colorimetric assay of GABA were determined as 2%and 2.08%,respectively.The optimum conditions for paper chromatographyspectrophotometry assay were as follows:the ratio of developing solvent n-butanol,glacial acetic acid,and water was 4∶1∶3(V∶V∶V),the temperature and time for color development were set at 80℃and 30 min,respectively,and the detection wavelength was set at 510 nm.

γ-aminobutyrate;Lactobacillus delbruckii;GABA detection

TQ92

A

1674-2214（2016）04-0226-06

2016-10-11

浙江省重点研发计划资助项目（2015C02053）

刘梦云（1990—），女，河南周口人，硕士研究生，研究方向为生物化工，E-mail：738257827@qq.com.通信作者:刘士旺教授，E-mail：shiwangliu@163.com.