化学酶法合成D-泛解酸内酯的研究进展

汪钊，黄美娟，高亮，应向贤，赵，孙杰

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

化学酶法合成D-泛解酸内酯的研究进展

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

泛酸俗称维生素B5，是辅酶A合成的前体，而D-泛解酸内酯是D-泛酸合成的前体。D-泛解酸内酯的化学合成是以甲醛和异丁醛为起始原料，经醛缩合、腈化及内酯化等反应生成DL-泛解酸内酯，再经选择性拆分得到D-泛解酸内酯。化学法与酶法相结合有助于高效、绿色地合成高光学纯度的D-泛解酸内酯。内酯水解酶催化混旋泛解酸内酯的选择性拆分已经成功地实现了工业生产。对羰基还原酶、醇脱氢酶和羟基腈裂合酶等在化学酶法合成D-泛解酸内酯中的最新进展进行了综述。

D-泛解酸内酯；氧化还原酶；羟基腈裂合酶；内酯水解酶

D-泛酸存在于植物以及低等生物的代谢过程中，被称为遍多酸或本多酸，是水溶性维生素B族的一种[1]。D-泛酸的发现历程久远，1933年由WILLIAMS R J从肝脏中提取出来，可以治愈鸡糙皮病，并在1940年人工合成成功[2]。目前D-泛酸在生物体内的代谢途径已经确定，即经α-酮异戊酸，利用酮泛解酸羟甲基转移酶生成酮泛解酸，再利用酮泛解酸还原酶形成泛解酸，最后与β-丙氨酸形成D-泛酸[3]。目前，国内对维生素B5的年需求量达2 000 t以上，而全球年需求量达10 000 t以上[4]。

D-泛解酸内酯是合成D-泛酸的重要中间体。化学法合成D-泛解酸内酯，从低廉原料出发经多步反应合成，工艺成熟，但总体存在化学条件严苛、酸碱用量大和能耗较高等问题。生物技术的发展为生物酶法合成D-泛解酸内酯提供了充分的可行性。目前工业化合成D-泛解酸内酯采用的是化学法与水解酶拆分法相结合的技术路线。笔者着重综述了生物酶法替代相关化学反应，并与化学法相结合应用于D-泛解酸内酯合成中的最新进展。

1 化学法合成D-泛解酸内酯

化学法合成D-泛解酸内酯常常从羟醛缩合开始，利用廉价的异丁醛和甲醛进行合成，该工艺已经非常成熟[5-6]，其化学合成过程如图1所示。异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛，再添加氢氰酸，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯；外消旋的内酯利用化学手性拆分剂或对映异构体过量结晶分离出D-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯；L-泛解酸内酯经过化学内消旋化再形成DL-泛解酸内酯，重复利用。动力学拆分中D-泛解酸内酯的理论收率可达100%。

2 化学酶法合成D-泛解酸内酯

泛酸具有一个手性中心，其中D-泛酸是工业生产所需要的。化学法合成D-泛酸（或泛酸钙）工艺成熟，但步骤繁琐且对消旋化产物进行结晶拆分费用昂贵。利用生物酶法生产光学纯的D-泛酸可进一步升级合成工艺，提升产品的竞争力。生物酶法主要包括利用生物菌体发酵生产和酶法催化。生物菌体发酵法利用基因工程技术在大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等宿主菌中表达泛酸生物合成基因和氨基酸生物合成基因，并利用基因工程菌进行微生物发酵[7-11]，泛酸产量较高，但微生物发酵法发酵液成分复杂，后续的产物分离提取较困难。酶法催化可以替代化学反应过程中的某些步骤，以化学酶法的方式来实现D-泛酸的前体物质D-泛酸内酯的生产。目前国内外酶法催化生产D-泛解酸内酯的方法主要包括酶法选择性拆分和酶法不对称合成。关于酶法不对称合成，笔者主要综述了三种路线：1）前手性物质酮泛解酸或酮泛解酸内酯不对称还原成D-泛解酸内酯；2）利用(R)-羟基腈裂合酶来合成泛解酸内酯前体羟基特戊醛；3）醇脱氢酶参与的化学酶法合成D-泛解酸内酯。

2.1 水解酶催化选择性拆分制备D-泛解酸内酯

DL-泛解酸内酯可经手性拆分得到所需要的D-泛解酸内酯。化学法拆分所需的化学拆分剂或结晶操作一般较为昂贵，而利用水解酶催化的动力学拆分，具有节能环保、产品光学纯度高等优点，更适用于工业生产。水解酶选择性水解泛解酸内酯，根据选择性可分为L-泛解酸内酯水解酶和D-泛解酸内酯水解酶。

DL-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯水解酶水解，留下D-泛解酸内酯，产生的L-泛解酸再经化学内酯、外消旋转为DL-泛解酸内酯，该过程如图2所示。已知的L-泛解酸内酯水解酶，大多来源于细菌[12]，如多形无色杆菌、苏云金芽孢杆菌、放射性土壤杆菌、根癌农杆菌。其中Kataoka M等[13]发现来源于根癌农杆菌的L-泛解酸内酯水解酶有较高的活力和选择性。Kesseler M等[14]对根癌农杆菌lu678的L-泛解酸内酯水解酶构建大肠工程菌并过量表达该蛋白，酶活提高了200倍，达到600 U/g。该过程要求L-泛解酸内酯必须完全水解，才能获得高光学纯度的D-泛解酸内酯，限制了其工业应用。

D-泛解酸内酯水解酶选择性水解拆分DL-泛解酸内酯生成D-泛解酸，再经内酯化生成D-泛解酸内酯，留下的L-泛解酸内酯经化学消旋化为DL-泛解酸内酯重新循环拆分，其拆分方法如图3所示。D-泛解酸内酯水解酶来源丰富，其中最常用的是镰饱霉菌，有尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌和串珠镰刀菌[12]。2007年，SAKAMOTO K等[15]利用固定化的尖孢镰刀菌来水解拆分DL-泛解酸内酯，固定化细胞的半衰期可以达到6 000 h，经过180次重复利用后仍然保持原活力的71%，相对于游离的整细胞催化，其半衰期提高了35倍。

2.2 氧化还原酶催化不对称还原制备D-泛解酸

内酯

氧化还原酶不对称还原酮泛解酸内酯的方法如图4所示，用L-泛解酸内酯脱氢酶将L-泛解酸内酯氧化成酮泛解酸内酯，再利用酮泛解酸内酯还原酶将其不对称还原成D-泛解酸内酯。该方法也可将外消旋的泛解酸内酯作为起始原料，经过氧化还原反应后得到D-泛解酸内酯，过程简单，不需要化学法中的再消旋化反应。

早在1973年，KING H L等[16]就研究发现一种来源于酿酒酵母的NADP（H）依赖型的酮泛解酸还原酶能够将酮泛解酸还原为D-泛解酸内酯，该酶在pH 7.0条件下需要2.2 min反应延滞期才会催化酮泛解酸内酯形成D-泛解酸内酯。

1984年，日本学者SHIMIZU S等[17]筛选了一系列能够还原酮泛解酸内酯形成泛解酸内酯的微生物菌种，其中小红酵母、不对称掷孢酵母、近平滑假丝酵母、粟酒裂殖酵母、清酒酵母、黑曲霉和萱草丝衣霉菌能够催化酮泛解酸内酯形成D-泛解酸内酯。1987年SHIMIZU S[18]等利用氧化还原系统从消旋化的泛解酸内酯出发，经诺卡式菌选择性氧化L-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，后者经近平滑假丝酵母不对称还原成D-泛解酸内酯。

SHIMIZU S等[19]进一步研究发现一株红串红球菌可以直接完成该氧化还原过程，说明红串红球菌自身不仅可以产L-泛解酸内酯脱氢酶，还可以产还原过程所需的酮泛解酸内酯还原酶。同时他们还提出酮泛解酸内酯在中性pH条件下会发生自发水解形成酮泛解酸，酮泛解酸再经过大肠杆菌中酮泛解酸还原酶催化形成D-泛解酸，而后在酸性条件下闭环成D-泛解酸内酯（图5），这就解释了1973年发现酮泛解酸还原酶延滞2.2 min起作用的原因。

KATAOKA M等于1992年分离纯化出星状诺卡氏菌生产的L-泛解酸内酯脱氢酶，但比酶活只有0.041 7 U/mg。该菌的基因组信息已被披露，然而至今未有构建其L-泛解酸内酯脱氢酶基因工程菌的报道。2009年，王永泽等利用面包酵母生产酮泛解酸内酯还原酶，并利用β-环糊精结合底物，减少底物对菌体的毒害作用，终产物得率达45%，光学纯度达到90%以上。SI D等[20-21]于2012年在嗜麦芽寡养单孢菌845中克隆一个大小约为30 kDa的酮泛解酸还原酶，并与葡萄糖脱氢酶共表达成大肠工程菌，构建辅酶循环体系。该大肠工程菌的酮泛解酸还原酶的比酶活达到27.7 U/mg。

2.3 羟基腈裂合酶催化不对称合成D-泛解酸内酯前体(R)-氰醇

(R)-氰醇是D-泛解酸内酯的前体物质，可经过水解生产D-泛解酸内酯。利用(R)-羟基腈裂合酶催化HCN与羟基特戊醛的羰基碳不对称加成进而合成(R)-氰醇[22]的过程如图6所示。大多数参与醇腈化反应的酶主要存在于高等植物中[23]，例如巴旦杏、苹果、蔷薇、橡胶树、亚麻类等，在植物体内羟基腈裂解酶催化形成氢腈酸从而抵御外来物种的入侵。2007年荷兰DSM公司从巴旦杏中提取分离的(R)-羟基腈裂合酶能选择性合成(R) -氰醇，并构建了粟酒裂殖酵母工程菌。2014年，DSM公司[24]将来自蔷薇科的(R)-羟基腈裂合酶基因构建于pJET重组质粒，并导入巴斯德酵母中表达，确定了该重组酶最适条件范围为15～20℃以及pH 2.5～3.0。在15℃和pH 2.5下醇腈化反应2 d，反应收率达到93%，转化率达100%，产物光学纯度达92%。

2.4 醇脱氢酶参与的化学酶法合成D-泛解酸内酯

与D-泛解酸内酯的工业合成类似，从缩醛反应出发再经醇脱氢酶还原，仅经过三步就合成了D-泛解酸内酯。这种醇脱氢酶参与的化学酶法合成过程由德国比勒费尔德大学HEIDLINDEMANN M等[6]在2015年设计，路线如图7所示。该方法以异丁醛和乙醛酸乙酯为起始原料，以L-组氨酸作为有机催化剂在酸性条件下发生醛醛缩合反应，得到(R)-中间体1。醇脱氢酶以异丙醇为辅底物实现辅酶循环，将中间体1还原成中间体2，中间体2无需分离直接自发环化成D-泛解酸内酯。反应中D-泛解酸内酯的总得率达55%，产物e.e.值达到95%。

3 结论

化学法与水解酶拆分法相结合合成D-泛解酸内酯凭借其成熟的工艺，目前在工业生产中占据绝对重要地位。随着国内环保要求的日益趋严以及产能扩大带来的竞争压力，升级D-泛解酸内酯的合成工艺势在必行。诸多的研究表明，微生物或者酶的应用有助于高效、绿色地合成高光学纯度的D-泛解酸内酯。内酯水解酶催化混旋泛解酸内酯的选择性拆分已经成功地实现了工业生产，而羰基还原酶、醇脱氢酶和羟基腈裂合酶等也已在化学酶法合成D-泛解酸内酯方面展现出了巨大的应用潜力。后续利用基因工程、蛋白质工程以及反应工程等技术，提高酶的表达量，改善酶的催化性能，优化催化反应条件，必将进一步提升化学酶法合成D-泛解酸内酯的技术竞争力。

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（责任编辑：朱小惠）

Research progress of chemo-enzymatic synthesis of D-pantolactone

WANG Zhao,HUANG Meijuan,GAO Liang,YING Xiangxian,ZHAO Man，SUN Jie
（College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）

D-pantothenic acid,commonly known as vitamin B5,is the precursor of coenzyme A, while D-pantolactone is the key intermediate of D-pantothenic acid.Racemic pantolactone is synthesized via aldol condensation using isobutanal and formaldehyde,followed by cyanation and lactonization under acidic condition.Furthermore,D-pantolactone is obtained through kinetic resolution of racemic pantolactone.The use of chemo-enzymatic method facilitates the efficient and green synthesis of D-pantolactone with high optical purity.Lactonase-catalyzed selective hydrolysis of DL-pantolactone has been successfully applied in industrial production.This paper reviews the research progress of chemo-enzymatic synthesis of D-pantolactone using carbonyl reductase,alcohol dehydrogenase and hydroxynitrile lyase as biocatalyst.

D-pantolactone;oxidoreductase;hydroxynitrile lyase;lactonase

TQ033

A

1674-2214（2016）04-0193-06

2016-03-03

浙江省自然科学基金资助项目（LQ14C010002，LQ16C020003）

汪钊（1960—），男，安徽歙县人，教授，研究方向为生物催化，E-mail:hzwangzhao@163.com.