环氧化物水解酶的特性及其应用研究进展

王志才，邹树平，顾恺，郑裕国

（浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014）

环氧化物水解酶的特性及其应用研究进展

王志才，邹树平，顾恺，郑裕国

（浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014）

微生物环氧化物水解酶来源广泛，立体选择性高，在手性环氧化物和手性二醇的合成中具有巨大的应用潜力。综述了环氧化物水解酶微生物来源、酶学性质、酶的结构与催化机理；着重介绍了近年来微生物来源环氧化物水解酶的分子改造及在手性化学品合成制备中的应用研究进展；指出了微生物来源环氧化物水解酶现阶段存在的问题并对未来发展方向进行了展望。

环氧化物水解酶；生物转化；蛋白质工程；催化机制；手性环氧化物

环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase,EH,EC 3.3.2.3），又称环氧化物水合酶，能够立体选择性地催化外消旋环氧化物水解，生成相应的1,2-二醇和光学活性的环氧化物[1]。EH广泛存在于自然界中，在细菌、酵母、霉菌、植物、昆虫以及哺乳动物中均发现有EH的存在。微生物EH序列大多属于α/β折叠水解酶家族，该类酶具有优良的对映体选择性，使其在手性药物和精细化学品制备中具有重要的应用价值[2]。

笔者主要综述了EH的研究现状，着重于该酶的微生物来源、酶学特性、结构及催化机制、蛋白质工程以及在生物催化过程中的应用。

1 环氧化物水解酶的微生物来源

大多数微生物来源的EH均以特定的环氧化物作为唯一碳源，如环氧氯丙烷，1-反式-2,3-环氧琥珀酸，1,2-环氧己烷等。1970年，Niehaus等[3]发现EH参与催化反应过程中表现出了立体选择性和区域选择性。Wijngaard等[4]以环氧氯丙烷为碳源从淡水沉淀物中成功筛选分离出一株具备EH活性的放射性土壤农杆菌（Agrobacterium radiobacterAD1）。随后，利用顺式环氧琥珀酸和多环芳烃作为唯一碳源，从土壤（油浸土）中分离出的六株红球菌均表现出EH活性[5]。此后，来源于Pseudomonas putida，Pseudomonas sp.strain AD1，Corynebacterium sp.strain N-1074，Corynebacterium sp.C12，Rhodococcus sp.（NOVO SP 409），Rhodococcus sp.NCIMB 11216，Aspergillus niger（LCP 521），Aspergillus niger ZJB-09101，Beauveria sulfurescens（ATCC7159），Xanthophyllomyces dendrorhous，DiplodiagossipinaATCC16391，BacillusmegateriumECU1001，Trichosporonloubierii ECU1040，Agromyces sp.ZJB09106等微生物的EH先后被分离并表征[6]。

2 环氧化物水解酶的酶学性质

一般表征目的酶的酶学性质需要电泳纯的酶液，该纯度的酶液也是生物转化生产精细化学品的理想催化剂，相比较于全细胞生物催化剂，电泳纯酶液催化具有目的产物单一、副产物少等优势。已报道的EH纯化方法涉及硫酸铵沉淀法、疏水层析、亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤法等。表1列出了已报道EH的酶学性质，可以看出：EH的分子量均介于28～66 kDa之间，其中来源于黑曲霉的EH分子量均在40～45 kDa之间；pH对酶的活性和稳定性影响显著，绝大多数EH最适pH介于7.0～9.0之间，但来源于A.brasiliensis CCT1435和A.niger M200的EH分别在pH为6.0和6.8时表现出最大活力；除了来源于Klebsiella sp.BK-58的EH在50℃表现出最大活力外，EH的最适温度均介于30℃到45℃之间；卤代烷酸和羧酸可以抑制相当大一部分酶的活力，例如，间氯过氧苯甲酸、ω-溴-4-对硝基苯乙酮可以使来源于A.niger黑曲霉的EH完全失活，对氯汞苯甲酸可使来源于Corynebacterium sp.strainN-1074和Pseudomonas pufida的EH活力丧失[7-8]，环氧琥珀酸和乙二胺四乙酸（EDTA）可使来源于P.pufida和Bordetella sp.strain 1-3的EH丧失活性[8-9]；金属离子Ag+, Hg2+,Fe2+,Cu2+和强氧化剂H2O2也严重影响EH活力。

表1 EH酶学性质概述

3 环氧化物水解酶结构和催化机制

研究酶的3D结构可以解释结构与功能的关系，更好地解析酶的催化机理。首个EH的3D结构是由Nardini等[10]在1999年解析出来（分辨率2.1Å），该酶来源于A.radiobacter，序列和结构分析表明该酶属于α/β折叠水解酶家族，为双二聚体相互作用组成的四聚体，每个亚基由7个α-螺旋和8个β-折叠组成（图1）。活性位点残基Asp107和His275位于核心区域和帽子区域之间主要疏水腔内，中心结构域是由残基Gly37，Trp38，Pro39，Glu44，His106，Asp107，Phe108，Ile133，Phe137，Ile219，His275，Phe276和Val279以及帽子区域残基Tyr152，Trp183和Tyr215组成。这一特点和来自A.radiobacter的卤醇脱卤酶（HheC,HHDH,EC 4.5.1.X）极其类似。Zou等[11]于2000年报道了A. niger EH的晶体结构（1.8 Å分辨率），并将其与来源于A.radiobacter的EH晶体结构比较，发现二者的三级和四级结构类似，并具有类似的活性区域以及帽子区域。接着将来源于Mycobacterium tuberculosis的EH和来源于Bacillus megaterium的EH晶体结构与来源于A.radiobacter的EH晶体结构相比较，发现前两者与后者结构核心区域重合较好，而帽子区域差异较大[12]。

Rink等[13]通过定点突变确定来源于A.radiobacter的EH催化三联体为Asp107，His275和Asp246，其催化机制与卤醇脱卤酶是类似的两步催化。首先，Asp107攻击环氧化物中伯碳原子形成共价脂中间体。然后，被His275和Asp246作用对活化的水分子水解脂键释放相应的邻二醇（图2（a）），与Asp107紧邻的Phe108在此过程中可能起到开环的作用，Tyr152/Tyr215在底物结合、过渡态的稳定以及环氧化物质子化中具有重要作用[14]。2014年Kong等[12]通过来源于B.megaterium的EH晶体结构结合已报道的环氧化物水解酶结构，确定了该EH的催化三联体，即Asp97，Asp239和His267，其催化机理为：第一步环氧底物进入活性中心后，由Asp97的羧酸亲和攻击环氧β碳原子形成脂键连接的底物-酶中间体，同时由Tyr144或Tyr203对环氧氧原子进行质子化；第二步为由Asp239和His267活化的水分子亲和攻击共价脂键中的羰基碳原子形成四面体结构的过渡态，进而释放产物邻二醇；其中Tyr144和Tyr203参与底物结合与质子化，氧洞残基为Phe30和Trp98，此外Typ98与底物存在相互作用，稳定了底物结合的构象。对比发现，同为微生物来源的两个EH各自的催化机理是极其相似的。

4 环氧化物水解酶的蛋白质工程

理想的生物催化剂需要具备高效的催化活性、良好的稳定性（温度、pH）、高对映体选择性以及易重复利用等特性，这些特性对于实现工业生产以及降低成本具有重要意义。然而，大多数来源于野生菌的酶并不具备我们所期望的这些特性，从而很难直接应用到工业化生产当中。近年来研究发现利用蛋白质工程，以原始酶为“原料”可以量身定制各类具有工业化价值的生物催化剂。蛋白质工程可分为理性设计和定向进化，已有报道指出通过蛋白质工程可成功提高EH的立体选择性、活性和稳定性。

Baratti等[15]对来源于A.niger的EH进行了重组表达，借助易错PCR的方法进行定向进化，将该酶对4-（对硝基苯氧基）-1,2-环氧丁烷的催化效率提高3.3倍。2011年Reetz等[16]利用定向进化策略对来源于A.niger的EH的表达效率进行改造，利用LacZα作为报告蛋白来筛选目的菌落，从突变库中筛选到最优突变体的表达效率比原始酶提高了近50倍。

来源于A.radiobacter的EH和A.niger的EH3D结构和催化机制相继被解析报道为理性设计提供了诸多可能。Reetz等[17]在通过迭代饱和突变（ISM）对来源于A.niger LCP 521的EH进行改造时引入了一种高效的组合试验方法，即组合活性位点饱和试验法（CAST），该法使用2个或3个活性位点残基的全部密码子组或一个子集进行饱和诱变，其重点是创建相对较小的突变库，有利于筛选出对底物的对映体选择性有明显提高的突变体，经过五轮突变，筛选得到的最优突变对底物苯基缩水甘油醚的对映体选择性由4.6提高到115（42倍）。该突变菌相比较于突变前对R构型底物侧链空间位阻增加，从而对R构型底物水解速度显著降低，而水解S构型底物速度保持不变，故大大提高了其对映体选择性。2013年，Arand等[18]对宏基因组来源的Kau2-EH进行迭代饱和突变，经过8轮反复突变，得到突变体F:13-B11（Trp110Leu/Phe113Val/Phe161Tyr/Pro193Gly/Val 290Trp），使其对底物对氯氧化苯乙烯e.e.值由84%提高至93%，突变体wt-sd（Val290Tyr）对底物对氯氧化苯乙烯对映体选择性提高5倍。Rui等[19]利用半理性设计对来源于A.radiobacter的EH在Phe108，Ile219，Ile111和Cys248四个特定的位点进行3轮ISM突变以期积累有益突变。突变体Phe108Leu/Ile219Leu/Cys248Ile对底物顺式-二氯乙烯活力提高10倍，对环氧己烷活力提高2倍，对环氧氯丙烷活力提高6倍。本课题组利用定点（饱和）突变对来源于A.radiobacter的重组大肠杆菌EH实施分子改造，得到的最优突变菌株IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys较原始酶活力提高4.4倍，对映体选择性提高2.1倍。Kong等[20]解析了来源于B.megaterium ECU1001的EH的晶体结构，并对其进行了分子改造，突变体Met145Ala，Phe128Ala和Phe128Ser对底物α-萘基缩水甘油活力分别提高25，42和434倍。2015年，本课题组借助同源建模和热点分析，对来源于Agromyces mediolanus ZJB120203的EH进行定点饱和突变，利用96孔板显色反应从2000株突变菌中得到最优菌Trp182Phe/Ser207Val/ Asn240Asp，其对底物环氧氯丙烷活力提高7倍，对映体选择性提高1.7倍[21]。

5 环氧化物水解酶的生物催化应用

5.1 动力学拆分

利用微生物来源的EH拆分外消旋环氧化物合成手性化合物和相应的邻二醇已成为近年来的研究热点。Pedragosa-Moreau等[22]首次利用来源A.niger（LCP 521）的EH拆分外消旋香叶醇氨基甲酸酯类，得到e.e.值为94%的S构型产物，收率可达42%（理论最高为50%），此外，该EH同时表现出对外消旋氧化苯乙烯的活力，拆分2 h后S-环氧苯乙烯e.e.值可达99%（收率为28%），对应产物R-邻二醇e.e.值可达60%～70%。来源于细菌的EH用于生物转化过程中具备两个诱人的特点：不会产生致密的菌丝体和易实现克隆增殖。在利用来源于A.radiobacter AD1的EH突变株Tyr215Phe克级制备手性2-吡啶基乙烷过程中，在底物浓度为127 mmol/L下，拆分得到S-2-吡啶基乙烷e.e.值达到98%，收率为36%，相应的产物R-邻二醇e.e.达到81%，收率为40%[23]。Zou等[24]借助来源于A.radiobacter AD1的重组EH筛选出最适该酶催化的水-异辛烷两相反应体系对映体水解ECH制备R-ECH，相较于单水相底物浓度提高了55%，达到574 mmol/L，R-ECH收率达到37.5%，e.e.值为99.3%，时空产率为0.286 mol/（L· h）。2015年，本课题组利用重组来源于A.mediolanus的EH大肠杆菌突变体VDF拆分外消旋环氧氯丙烷，在高底物浓度下（450 mmol/L），得到手性纯（e.e.>99%）的S-环氧氯丙烷收率达到40.5%[21]。

5.2 对映归一性水解

对于传统的动力学拆分而言，其内在的缺陷在于手性纯产物收率理论最大值仅为50%。以下三种方法可以克服动力学拆分存在的收率偏低的问题：前手性底物的不对称合成、动态动力学拆分外消旋化合物以及借助互补酶或化学-酶法耦合对映归一性水解反应。Pedragosa-Moreau等[22]使用不同微生物来源、对映体偏好性互补的双酶策略对映归一性水解氧化苯乙烯以期得到手性纯的相应邻二醇，其产物e.e.值达98%，收率为85%。另外，对映归一性水解反应也可借助同时表现对不同构型底物具有不同对映体选择偏好的单酶来实现，例如来源于Nocardia的EH I就具备该特点，其能对映归一性水解（±）-顺式-2,3-环氧庚烷得到手性纯的相应邻二醇，e.e.值达91%，收率为79%[25]。

另一种实现对映归一性水解的途径为通过化学-酶耦合法来实现。第一种类型：首先EH将外消旋底物的一种构型水解为对应邻二醇，而后利用化学法使得另外一种对映异构体转化为相同构型的邻二醇，基于这一反应类型，成功制备出（1S, 2S）-1-甲基环己烷-1,2-二醇（e.e.值为95%，收率为80%）和（R）-对硝基苯乙烯二醇（e.e.值为80%，收率为94%）[26-27]；第二种反应类型：一种构型的底物被EH水解为相应的邻二醇，而后利用化学催化方法将该邻二醇环化为另一构型底物。Monfort等[28]利用该对映归一性水解类型成功制备出（S）-邻氯（2,4-二氟苯基）-2,3-环氧丙烷，其e.e.值为98%。

6 结论

EH作为生物催化剂可通过对映体拆分或对映归一性水解反应用于制备手性环氧化物以及对应的邻二醇。EH潜在的应用价值引起学者们的极大兴趣，加之近年来手性环氧化物需求急剧增加，探索新型EH显得尤为重要。随着诸如宏基因组技术的新型酶筛选方法的引入，一些具有应用前景的新型EH有望被相继发现，例如耐高底物浓度以及对产物耐受性增强的新型EH是今后探索的一个方向。针对现有EH，可结合定点突变以及定向进化等分子修饰方法提高其活性、稳定性、对映体选择性以及拓宽其底物谱，使其更适合工业应用和高附加值的化学品和药品生产。另外，进一步提升对EH序列-结构-活性-对映体选择性之间的关系，更深入了解EH的反应机制同样具有重要意义。

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（责任编辑：朱小惠）

Properties and applications of microbial epoxide hydrolase

WANG Zhicai,ZOU Shuping,GU Kai，ZHENG Yuguo
（Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）

Due to the extensive sources and high stereoselectivity,microbial epoxide hydrolasehas a great potentials in the synthesis of chiral epoxides and corresponding diols.The microbial sources,enzymatic properties,crystal structure and catalytic mechanism of epoxide hydrolase were reviewed in this paper.The research progress on the protein engineering of epoxide hydrolase and its applicationin the preparation of chiral chemicals were introduced in detail.The existing problems of microbial epoxide hydrolase were pointed out and future development direction is prospected.

epoxide hydrolase;biotransformation;protein engineering;catalytic mechanism;chiral epoxide

Q814.9

A

1674-2214（2016）04-0204-06

2016-03-30

国家自然科学青年基金资助项目（21406205）

王志才（1991—），男，安徽太和人，硕士，研究方向为手性生物催化与酶工程，E-mail：wangzhangzctt@163.com.通信作者：郑裕国教授，E-mail:zhengyg@zjut.edu.cn.