二肽的生物合成及应用研究进展

范晓光，洪翔，朱新雅，张成林，陈宁

（1.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津300457；2.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津300457；3.天津科技大学生物工程学院，天津300457）

二肽的生物合成及应用研究进展

范晓光1,2,3，洪翔1,2,3，朱新雅1,2,3，张成林1,2,3，陈宁1,2,3

（1.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津300457；2.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津300457；3.天津科技大学生物工程学院，天津300457）

二肽是由两个氨基酸组成的最简单的肽，但与蛋白质和氨基酸相比，由于缺少有效的制备方法，许多二肽的生理功能尚不清楚。目前，只有少数二肽实现了商业化，如阿斯巴甜（L-天门冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）以及丙谷二肽（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）等。近年来，随着微生物体内一些非依赖于核糖体系统的二肽合成途径的发现，使得人们开始利用酶转化或发酵的方法制备不同种类的二肽。因此，对一些商品化二肽的功能和应用、二肽的现有制备方法以及生物合成二肽的技术和新思路进行综述。

二肽；生理功能；制备方法；生物合成

二肽是由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键（即—CO—NH—）组成的蛋白质片段或物质。二肽分子中一般包含一个肽键，特殊的二肽如环二肽则可以存在两个肽键。近年来，随着一些商品化二肽产品如阿斯巴甜（L-天门冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）以及丙谷二肽（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）在食品和医药行业中的广泛应用，人们对于二肽的营养与功能越发关注。但与此同时，由于缺乏合理有效的制备方法，许多二肽产品的开发和应用研究停滞不前。笔者将结合现有的研究报道，对一些商品化二肽的功能和应用、二肽的现有制备方法以及生物合成二肽的技术和新思路进行综述。

1 二肽的功能和应用

二肽在生物体内会被分解为氨基酸，因此二肽具有相应氨基酸的功能，但其物化性质却不同于相应氨基酸[1]。例如，谷氨酰胺是人体所需的重要氨基酸，但热稳定性较差，而丙氨酰-谷氨酰胺的热稳定较高；酪氨酸几乎不溶于水，但丙氨酰-酪氨酸在水中的溶解度可达到14 g/L。有意思的是，一些二肽要比其两种相应氨基酸的溶解性更好，例如丙氨酸和谷氨酰胺在水中的溶解度分别为89 g/L和36 g/L，而丙氨酰-谷氨酰胺的溶解度则可达到586 g/L。基于上述性质，这类二肽如Ala-Gln和Gly-Tyr常作为注射液的主要营养组成成分应用于患者的术后恢复[2]。除了物化性质改变以外，一些二肽本身还具有氨基酸所不具备的特殊生理功能。肌肽，又名β-丙氨酰-L-组氨酸，是由β-丙氨酸和L-组氨酸构成的二肽化合物，广泛存在于肌肉细胞和脑部组织细胞。研究结果表明肌肽在细胞内具有一定的抗氧化能力，可清除在氧化应激过程中脂肪酸过度氧化形成的活性氧自由基（ROS）以及α，β不饱和醛[3]。鹅肌肽是由β-丙氨酸和甲基-L-组氨酸构成的一种水溶性二肽化合物，广泛存在于脊椎动物的骨骼肌组织和脑组织中，在酸性条件下（pH＜3.0）能够稳定存在。鹅肌肽与肌肽在结构和生物学功能上相近，在食品工业中已用作天然的抗氧化剂，在医药领域作为抗氧化和抗衰老保健品使用[4]。阿斯巴甜（L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）是为数不多的具有甜味的二肽类衍生物，甜度是蔗糖的200倍左右，比蔗糖所含热量少。使人感到甜味所需的阿斯巴甜用量非常少，以至于可忽略其所含的热量，所以阿斯巴甜被广泛用作蔗糖的替代品[5]。目前，世界上有超过90个国家批准使用阿斯巴甜作为食品添加剂。此外，存在于鱼肉、海藻或蘑菇水解液或提取物中的二肽（如Ile-Tyr，Lys-Trp，Val-Tyr，Ile-Trp）由于能够抑制人体内血管紧张素转化酶（ACE）的活性，发挥抗高血压的功效，在日本已批准作为特殊的营养保健品使用[6]。

2 二肽的现有制备方法

目前，二肽常用的制备方法包括天然提取法、化学合成法及化学-酶转化法。其中化学合成法和化学-酶转化法是制备二肽的经典方法，也是目前商品化二肽的主要生产方法。而天然提取法由于原料来源有限，植源性或动物源性的肽类化合物种类繁多，含量有限，不具备经济优势和大规模生产的可行性。

2.1 化学合成法

化学合成法是利用氨基酸作为原料，通过化学方法人工构建肽键制备二肽的方法，主要包括以下步骤[7]：1）保护除了肽键所需的官能团以外的其他所有的活性官能团；2）激活保护的氨基酸中游离的羧基；3）将激活的氨基酸与另一种已保护的氨基酸连接；4）去除二肽中所有的保护基团。化学合成法的优势在于通过选择合适的保护基团和激活剂能够合成多种二肽，且反应得率较高。同时，根据已知二肽的性质和功能，通过改变氨基酸上连接的结构，可以合成出天然无法获取的具有特殊结构的二肽，从而开发出特殊用途的药物及功能食品。因此，化学合成法是制备商品化二肽的主要方法。化学合成法的不足在于反应步骤及反应试剂较多导致的反应成本过高。同时，反应产物易于消旋化，副反应较多，有毒试剂的使用也会对人体造成潜在的危害。

2.2 化学-酶转化法

该方法运用蛋白酶和酯酶催化逆反应连接氨基酸，与化学法相比具有更专一的立体选择性，反应条件更温和。现已知两种反应机制：热力学控制和动力学控制的过程（图1）。热力学控制过程基于蛋白酶和酯酶的逆反应过程，在生理条件下酶反应更偏向于水解方向。为推动反应向肽键形成方向进行，可以利用产物沉淀，底物过量或者在两相条件下将产物从水相转移至另一不溶相中等方法促进合成反应[8-9]。动力学控制过程取决于适当活化的羧基端酯（或酰胺）迅速酰化一个丝氨酸或者半胱氨酸蛋白酶。酰基酶中间体经历了一个限速脱酰基反应，它发生在水与另一种亲核试剂的竞争中，该过程可以短暂积累产物。该机制下，二肽的产率取决于水和亲核试剂对酰基酶的攻击速度和二肽的水解速度，所以酶自身和反应条件如pH，离子强度和亲核试剂浓度都很重要[10-11]。

3 二肽的生物合成

生物体中多数的肽键合成反应是在细胞中核糖体的指导下进行的。但近年来，研究者们相继发现了一些非依赖于核糖体系统的肽键合成反应。这些反应所涉及到的酶包括：非核糖体肽合成酶（NRPS）[12]、聚谷氨酰胺合成酶[13]、藻青素合成酶[14]、谷胱甘肽合成酶[15]、L-氨基酸-α-连接酶（Lal）[16]等。上述酶催化合成的次级代谢产物往往是细胞组分形成或者细胞生长所必须的。其中NRPS和Lal的发现使得生物法制备二肽成为可能。

3.1 利用NRPS合成二肽

NRPS是一个很大的酶系，分子量达到了100～1 700 kDa。它由很多个具有独立催化能力的模块构成，每个模块含有一系列结构域用来把一个氨基酸作为底物结合到新生肽链上[17]。腺苷酰化结构域（A位点）负责识别氨基酸的类别并且通过腺苷酰化作用将其活化，这是一个需要消耗ATP的过程。活化过的氨基酸随后被转移到肽载体蛋白（PCP）上，PCP作为中介再将被活化的氨基酸转移到缩合结构域（C位点），氨基酸在此脱水缩合成肽。最后经硫酯结构域（Te位点）把合成的肽链从NRPS上释放出去（图2）。图2中闭合菱形和三角形代表两种不同氨基酸。A domain:腺苷酰化结构域；PCP domain：肽载体蛋白；C domain：缩合结构域；Te domain：硫酯结构域；A，PCP和C结构域共同组成一个模块。

NRPS系统已经成功地应用到二肽的合成中。Doeckel和Marahiel通过连接部分bac基因（在地衣芽孢杆菌中编码杆菌肽素生物合成的NRPS）和tyc基因（在短芽孢杆菌中编码短杆菌酪肽生物合成的NRPS），设计了二肽合成的生物模板[18]。其中第一个A区域BacA1，能够识别并激活异亮氨酸，将其跟TycC包含的C-PCP-A2（识别并激活亮氨酸）区域融合在一起，并通过4-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶在大肠杆菌中成功表达了人工合成的NRPS全酶。将此酶纯化后与异亮氨酸、亮氨酸和ATP混合形成了异亮氨酸-亮氨酸二肽。他们利用同样的策略完成了苯丙氨酸-亮氨酸和异亮氨酸-苯丙氨酸的生物合成。

尽管人们已经能够通过人工构建的NRPS全酶催化合成所需的二肽，但是仍有一些问题需要克服。第一个问题是C区域的选择性，这对于控制二肽合成的顺序至关重要；第二个问题是人工合成的NRPS的活力不够，使得二肽的产率较低。

3.2 利用Lal合成二肽

Lal属于ATP依赖型的羧酸盐-胺/硫醇连接酶超家族，使用酰基-磷酸盐作为活性中间体，如图3所示。该酶可以以无活性基团保护的氨基酸为底物合成二肽，其反应伴随着ATP到ADP的去磷酸化过程，但是不能催化合成三肽或更长的肽链。

第一个报道的Lal来源于Bacillus subtilis 168（ATCC 23857），由ywfE基因编码，负责催化L-Ala和抗荚膜菌素（L-anticapsin）形成二肽类抗生素芽孢杆菌溶素（bacilysin）[19]（图4）。晶体结构分析表明[20-21]：该酶N-末端的底物选择性较为严格，只能接受小分子酸性氨基酸（如L-Ala），而其C-末端的底物选择性相对宽泛，可以接受许多疏水性氨基酸如L-Phe和L-Met等，同时该酶不能识别D型氨基酸。随后，大约20种不同的Lal相继被发现，其对各种氨基酸的亲和力也有所不同。例如，Bacillus subtilis NBRC3134中rizA基因编码的Lal只能接受Arg作为其N-末端的底物[22]。Bacillus subtilis NBRC12200中BL00235基因编码的Lal只能接受Met和Leu作为其N-末端的底物[23]。然而，Pseudomonas syringae NBRC14081中tabS基因编码的Lal对底物的选择性较为宽泛，在236个待测的二肽合成反应中共检测到136个二肽产物，一些非常规的氨基酸如L-哌啶酸，羟基脯氨酸及β-丙氨酸亦可作为其催化底物[24]。

由于不同来源的Lal对底物氨基酸的亲和能力不同，因此目前研究更多集中在对Lal的定点改造以增强其对特定二肽的合成能力。例如，BL00235基因编码的Lal可以催化合成Met-Gly，但同时伴随着Met-Met副产物的产生，对该酶的晶体结构进行分析发现，将其85位Pro转变为芳香族氨基酸如Phe，Tyr和Trp等能够阻止该酶C-末端与Met的结合[25]。tabS基因编码的Lal可以催化20 mmol/L的Pro和20 mmol/L的Gly合成8.3 mmol/L的咸味肽Pro-Gly，其85位Ser以及294位His的改变能够显著影响酶的活力，其中S85T/ H294D突变酶催化的Pro-Gly产量增加了一倍[26]。

3.3 直接发酵法制备二肽

直接发酵法是将氨基酸发酵与Lal催化反应进行偶联，从而实现使用基础底物葡萄糖和氨水生产二肽的过程。但研究发现，在野生型大肠杆菌中表达Lal基因时没有二肽产生，这说明Lal对底物氨基酸的亲和力较低，同时菌体自身能够利用二肽作为氮源[27]。对于前一问题，可以通过提高底物氨基酸的通量予以克服，例如可以通过基因过表达或解除氨基酸对合成酶的反馈调控提高胞内底物氨基酸的浓度，从而增加Lal的底物选择性，减少其他二肽的产生。对于后一问题，可以通过破坏一些相关的蛋白酶基因和二肽摄取酶基因予以克服，例如敲除几个大肠杆菌中编码二肽酶或氨肽酶的pepA，pepB，pepD或pepN基因，弱化二肽运输蛋白基因dpp，能有效减少菌体自身对二肽的降解。Tabata和Hashimoto运用上述策略构建了一株产Ala-Gln的基因工程大肠杆菌。经过47 h的发酵培养，Ala-Gln的产量达到100 mmol/L（25 g/L），副产物Ala-Ala的产量为26 mmol/L（3.6 g/L），对葡萄糖的转化率达到11.5%[28]。

4 结论

二肽的生物合成技术目前仍处在初步研发阶段，但非核糖体肽合成酶以及L-氨基酸-α-连接酶的发现说明微生物中确实存在特异性的肽合成酶。与现有的二肽制备方法相比，使用基于NRPS以及Lal的生物合成技术制备二肽能够带来更好的经济效益和环境效益。在二肽发酵工程菌的构建方面，既需要通过合理设计NRPS或寻找同源的Lal来合成更多种类的二肽，又需要通过强化胞内氨基酸的供给及能量供应，减弱二肽降解和输入途径来增加二肽的积累。上述生物合成途径的建立和优化将有助于打破目前二肽的生产瓶颈，为更多种类二肽的制备及应用研究提供帮助。

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（责任编辑：朱小惠）

Research advances on the biosynthesis and application of dipeptides

FAN Xiaoguang1,2,3,HONG Xiang1,2,3,ZHU Xinya1,2,3,ZHANG Chenglin1,2,3,CHEN Ning1,2,3
(1.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology,Tianjin 300457,China;
2.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture,Tianjin 300457,China;
3.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Dipeptide is the simplest peptide composed of two amino acids.The functions of dipeptides have been poorly studied compared with proteins or amino acids due to the lack of efficient preparation method.Only a few dipeptides,such as aspartame(L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester)and L-alanyl-L-glutamine,are commercially used.Recently,the discovery of nonribosomal-dependent synthetic pathway of dipeptide enabled its production via enzymatic methodor fermentative processes.In this review,the functions and applications of dipeptides,as well as the existed methods and new strategies for dipeptide production are summarized.

dipeptides;physiological function;production methods;biosynthesis process

TQ922

A

1674-2214（2016）04-0199-05

2016-05-13

天津市科技特派员项目（15JCTPJC62800）

范晓光（1987—），男，天津人，讲师，博士，研究方向为代谢控制发酵，E-mail:xiaoguangfan@tust.edu.cn.