红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优

林晓婕，梁璋成，黄 飞，任香芸，林晓姿，何志刚*

(1. 福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350003；2.福建省农产品(食品)加工重点实验室，福建 福州 350003)



红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优

林晓婕1,2，梁璋成1,2，黄 飞1,2，任香芸1,2，林晓姿1,2，何志刚1,2*

(1. 福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350003；2.福建省农产品(食品)加工重点实验室，福建 福州 350003)

研究了固液比、提取温度和时间对制备的福建红曲米粗酶液酶活的影响，比较了以碘量法、DNS法和菲林试剂法的红曲米糖化力测定结果，并进行红曲黄酒酿造验证糖化力检测试验。结果表明，红曲米糖化酶最佳提取方式为选择固液比(m∶V)=1g∶25mL，红曲米粉末于缓冲液溶解摇匀后立即过滤，取滤液检测。碘量法与DNS法均为红曲米糖化酶适宜的检测方法，两种方法检测数据具有可比性。从时效性考虑，碘量法适宜少量样品测定，DNS法适宜用于快速测定多个样品。经酿造验证，红曲米糖化力的测定值与以其为糖化剂的黄酒出酒率检测结果是一致。

红曲米；糖化酶；糖化力

红曲米是我国传统发酵食品，以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料，用红曲霉菌发酵而成，在酿造福建黄酒过程中，发挥了提供色泽、风味和糖化等作用[1-2]。糖化力是衡量红曲米糖化力作用强弱的一个重要指标。然而，如何判断红曲米糖化力强弱至今没有统一标准。糖化酶提取方法直接影响到红曲米糖化力测定的高低，提取方式就有很多种，如温小英[3]等采用35℃浸提1 h的方法提取，汪志君[4]等采用30℃浸提1 h，马歌丽[8]等采用缓冲液直接提取。不同的提取方法对糖化酶活力影响不同，高温长时的提取方法有可能造成酶活损失。同时，测定糖化力的方法有很多，国标针对糖化酶制剂采用碘量法[5]，该方法准确可靠，操作复杂，尤其在处理大量样品时，分析速度慢，对糖化力较低的样品则颜色变化不明显，判断误差较大；胡卫明[6]、马耀宏[7]等采用菲林试剂法，此法应用较为广泛，但张凤英[8]等认为其影响因素较多，且操作繁琐、时间长，测定技术要求高，结果差异大；白利涛[9]、马歌丽[10]等研究了DNS法测定糖化酶活力，认为DNS法和碘量法在精密度和正确度上都无显著差异，操作简便，对于多个样品可实现快速测定；许明明[11]等采用试饭法直接测定。本研究考察了固液比、提取温度和提取时间对粗酶提取液酶活的影响，同时对比了碘量法、DNS法和菲林试剂法，并对酿造红曲米糖化力检测进行了验证试验，以期为酿造红曲米检测技术规程的制订以及红曲米糖化力评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原料

红曲米，由福建永春、平湖、三明、宁德等地收集。

1.2 仪器与药品

GX-04多功能粉碎机，上海高翔食品机械厂；电热恒温水浴锅；BS224S电子天平，赛多利斯科学仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂 0.05 mol·L-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)，DNS试剂，200 g·-1氢氧化钠，20 g·-1可溶性淀粉溶液，0.1%葡萄糖标准溶液。

1.3.2 粗酶液提取 红曲米用多功能粉碎机打成粉末(80目)，精确称取适量粉末，按试验设计以0.05 mol·L-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液为溶剂，经一定温度、时间下浸提后抽滤，洗涤3次，收集滤液定容至250 mL，待用。

1.3.3 单因素试验 为了考察固液比、提取温度和时间对粗酶提液酶活的影响，按1.3.2方法进行以下3个单因素试验。固液比(m/g∶V/mL)分别为1∶100、1∶50、1∶25、2∶25、3∶25、4∶25、5∶25，在40℃水浴中进行浸提40 min；以较优固液比，在4、20、30、40、50℃水浴中浸提40 min；以较优固液比，在最适温度水浴中分别进行浸提0、10、20、30、40 min。每处理重复2次。

1.4 3种检测方法比较

1.4.1 碘量法 参考GB 8276-2006，略作修改。

糖化酶酶解：取两支50 mL比色管(A、B管)，分别加入可溶性淀粉溶液10 mL和乙酸-乙酸钠缓冲液8 mL，摇匀。于40℃恒温水浴中预热5 ～10 min。在B管中加入待测酶液10.0 mL，立即记时，摇匀。在此温度下准确反应60 min后，立即向A、B管中各加氢氧化钠溶液0.2 mL，摇匀，同时将两管取出，迅速用水冷却，并于A管中补加待测酶液10.0 mL作为空白对照。

测定：吸取上述A、B两管中的反应液各5.0 mL，分别于两个碘量瓶中，准确加入碘标准溶液10.0 mL，再加氢氧化钠溶液15 mL，边加边摇匀，并于暗处放置15 min，取出。用水淋洗瓶盖，加入硫酸溶液2 mL，用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定蓝紫色溶液，直至刚好无色为其终点，分别记录空白和样品消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积(VA、VB)。

红曲米酶活力单位按下式计算：

X=(VA-VB)×cST×cG×(Vt/Vx)×(1/10)×n

式中：X为样品的酶活力单位即1 g红曲米在40℃、pH 4.6的条件下，1 h水解可溶性淀粉的产生1 mg葡萄糖为1个酶活力单位(U·g-1)；VA为滴定空白时，消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积(mL)；VB为滴定样品时，消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积(mL)；cST为硫代硫酸钠标准滴定溶液的准确浓度(mol·L-1)；cG为葡萄糖的摩尔质量， 90.05 g·mol-1；Vt为反应液的总体积， 24.2 L；Vx为吸取反应液的体积， 5 L；n为稀释倍数。

1.4.2 DNS法

(1)标准曲线制作：准确称取105～110℃干燥后的葡萄糖50 mg，用蒸馏水溶解，定容至50 mL容量瓶中，配置成1 mg·mL-1标准溶液，分别稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的标准工作溶液，分别吸取0.5 mL，分别于在25 mL 比色管中，加入1.5 mL DNS试剂混匀，在沸水浴中加热5 min后取出迅速冷却至室温，加水10 mL。以试剂空白作参比，用1 cm比色皿在520 nm测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。

(2)糖化力测定：糖化酶酶解方法与碘量法的相同测定方法参考马歌丽[10]、孙淑琴[12]，上述A、B两管中的反应液稀释至0.5 mL，分别于在25 mL 比色管中，加入1.5 mL DNS试剂在沸水浴中加热5 min后取出迅速冷却至室温，加水10 mL。以试剂空白作参比，用1 cm比色皿在520 nm测定吸光值，分别通过线性回归方程求出葡萄糖浓度。

红曲米酶活力单位按下式计算：

X= (cB-cA)×(Vt/VEX)×(VET/m)×n

式中：X为样品的酶活力，即1 g红曲米在40℃、pH 4.6的条件下，1 h水解可溶性淀粉的产生1 mg葡萄糖为1个酶活力单位(U·g-1)；cB为样品管的葡萄糖质量浓度 (mg·mL-1)；cA为样品空白管的葡萄糖质量浓度 (mg·mL-1)；Vt为反应液的总体积，单位为毫升(28.2 mL)；VEX为吸取待测酶液的体积，为10 mL；VET为提取待测酶液的总体积，为25 mL；m为称取红曲米粉末重量 (g)；n为稀释倍数。

1.4.3 菲林试剂法 方法参考马耀宏[7]等，略作修改。吸取25 mL 12%可溶性淀粉溶液，置于50 mL容量瓶，于35℃水浴预热10 min，加入5 mL酶提取液，摇匀，于35℃糖化1 h，迅速加入15 mL 0.1 mol·L-1NaOH，终止酶解反应，冷却至室温，定容。

吸取斐林试剂甲、乙液各5 mL，加入适量的0.1%标准葡萄糖液(使滴定时消耗0.1%标准葡萄糖液在1 mL以内)，准确加入5 mL上述酶解液，摇匀，于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，操作在1 min内完成，并同时做空白液滴定。

计算公式：

X=(V0-V)×C×(1/m)×105×n

式中：X为样品的酶活力单位即1 g红曲米在40℃、pH 4.6的条件下，1 h水解可溶性淀粉的产生1 mg葡萄糖为1个酶活力单位(U·g-1)；V0为滴定空白时，消耗0.1%标准葡萄糖液体积 (mL)；V为滴定样品时，消耗0.1%标准葡萄糖液体积 (mL)；c为标准葡萄糖溶液质量浓度 (g·mL-1)；m为红曲重量，单位为(g)；n为稀释倍数。

1.5 红曲黄酒酿造验证试验

采用传统发酵法，以糯米为原料，以5种红曲米为糖化剂，糯米经浸泡、蒸煮摊凉，以米饭∶水为1∶1落缸，按大米用量的10.0%接种红曲米，控温30℃发酵，发酵72 h后离心，检测酒精度和出酒率。

酒精度：采用高效液相色谱法测定酒精度[13]。

分析：学生都能用勾股定理求出AB的长是5，易知 A’(2，0)折叠吟AOB 交 y轴于点C，构造吟OA’C是直角三角形，设OC=x，则AC=4-x，在Rt吟OA’C 中由勾股定理得 OC2+OA2=CA’2，即 x2+22=(4-x)2，得到x=1.5，即 C(0，1.5)，求直线 BC 的解析式，知道 B(-3，0)，C(0，1.5)，用待定系数法求得y=0.5x+1.5。

残糖、总酸测定：参考GB/T 13662-2008 黄酒[14]中总糖、总酸的检测。

出酒率(以成品酒15度计)的测定：出酒率%=酒精度(%)×[出酒量(kg)/大米用量(kg)×100%

1.6 数据分析

采用DPS数据软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 液固比对粗酶提取的影响

采用DPS数据软件进行数据分析，不同液固比处理所得到的粗酶提取液酶活见图1。结果表明，固液比(m/g∶V/mL)分别为1∶100、1∶50、1∶25时，粗酶提取液酶活最高，三者无显著差异(P>0.05)，原因是缓冲液提取酶的量达到最大量，为操作简便，选择固液比为1∶25。

2.2 浸提温度对粗酶提取的影响

采用DPS数据软件进行数据分析，当固液比m/g∶V/mL=1∶25时，不同浸提温度处理所得到的粗酶提取液酶活见图2。结果表明，提取温度越低，酶活越低，原因可能是当提取温度升高，酶失活的比率逐渐上升，酶活降低；当提取温度为4℃时，酶活最高，与其他温度提取的酶活相比，差异均达极显著水平(P<0.01)。

2.3 浸提时间对粗酶提取的影响

采用DPS数据软件进行数据分析，在固液比m/g∶V/mL=1∶25、浸提温度4℃时，不同浸提时间处理所得到的粗酶提取液酶活见图3。结果表明，不同的浸提时间对粗酶提取液酶活没有显著差异，为了操作简便，选择混匀后立即过滤。

2.4 3种检测方法比较

对11种不同产地、不同来源的红曲米进行初筛，选择5种糖化力差异较大的红曲米(B1、R12、R21、R32、R8)，分别采用了碘量法、DNS法、菲林试剂法3种检测方法进行了糖化力测定，从图4可以看出，碘量法与DNS法检测结果基本一致，5种红曲米糖化力大小顺序依次为B1、R12、R21、R32、R8，排序一致，两种方法的测定结果无显著差异；菲林试剂法检测5种红曲米糖化力大小顺序依次为B1、R21、R32、R8、 R12，只有B1排序有相关性，其余4个样品检测结果均有一定的偏差，与张凤英[6]等研究结果一致，同时菲林试剂法检测值偏低。

3种检测方法对时间、试剂、设备等要求见表1，菲林试剂法操作难度较难，误差较大。

表1 3种检测方法的比较

检测方法可根据实际生产需求进行选择。在样品数量较少、设备条件有限的情况下，适宜选择碘量法检测红曲米糖化力；在样品数量较多，有分光光度计的条件下，可以选择DNS法快速测定多个样品，两种方法的测定值具有可比性。

2.5 红曲米糖化力验证试验

红曲米糖化力的高低，直接反映其液化糖化大米淀粉产生可发酵糖的水平，最终关系到出酒率。从图5可以看出，红曲米糖化力的差异与以其为糖化剂的黄酒出酒率的差异是一致的，进一步说明了检测数据是可信的。

3 讨论与结论

红曲的糖化力是反映红曲质量的重要标准之一。受制曲原料、加工工艺和生产条件的影响，不同产地、不同厂家甚至不同批次生产的酒曲，都存在较大差异。因此，针对红曲建立一个有效的糖化力评价方法，对于稳定酒曲质量、制曲企业制订行业标准、酿酒企业选择使用红曲，具有重要的指导意义。

DNS法的原理是糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应生成的棕红色3-氨基-5硝基-水杨酸，在520 nm波长处的光吸收强度与还原糖含量呈正比，利用分光光度计快速简便的测定酒曲糖化力[9]。试验结果表明， DNS法与碘量法检测结果基本一致，与以其为糖化剂的黄酒出酒率一致，可快速测定，且操作简便。碘量法与DNS法均为红曲米糖化酶适宜的检测方法，两方法检测数据具有可比性、数据可信。从时效性考虑，碘量法适宜少量样品测定，DNS法适宜用于快速测定多个样品。

斐林试剂法的原理是，利用糖化酶水解可溶性淀粉为葡萄糖，葡萄糖与斐林试剂反应，将二价铜在碱性条件下还原成一价的铜，后者与黄血盐生成不沉淀的络合物.用次甲基蓝为指示剂确定反应终点[8]。斐林试剂法的影响因素很多，操作繁琐、时间长，试验结果表明，测定结果与碘量法、DNS法存在较大的差异。

[1]韩兴林,王建耀,王广峰,等. 清香型大曲糖化力的简单分析[J]. 酿酒科技,2009，(9)：68-70.

[2]倪莉,吴智广,张雯. 福建红曲中的红曲霉的生理生化特性研究[J]. 福州大学学报：自然科学版，2009， 37(6)：931-934.

[3]温小英,廖勤俭,李扬华.一种酒醅糖化力的测定方法 [J].酿酒科技，2013，(5):100-104.

[4]汪志君,夏艳秋,方维明.植酸对黄曲霉菌(Aspergillusflavus)糖化力的影响[J].中国酿造，2003，22(5):14-16.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会. GB8267-2006 食品添加剂糖化酶制剂[S].北京：中国标准出版社，2006.

[6]胡卫明,高永强.新工艺黄酒麦曲的工艺及性能检测[J].酿酒，2013,40(1):103-106.

[7]马耀宏,孟庆军,杨艳,等.大曲糖化力的快速测定方法[J].中国酿造,2014,33(3):128-131.

[8]张凤英,吴芝岳,杨武英.测定小曲糖化力新方法的探讨[J].酿酒科技，2006，(4):99-104.

[9]白利涛,张丽萍.糖化酶活力测定方法研究[J].酿酒科技，2012，(2):99-102.

[10]马歌丽,魏泉增,张志刚.分光光度法测定大曲糖化酶活力探讨[J].中国酿造.2008，27(17):69-71.

[11]许明明,吕旭聪,刘志彬,等.福建药白曲中根霉的分离鉴定及菌株特性分析[J].中国食品学报，2014,14(3):205-210.

[12]孙淑琴,邵冬梅.比色法快速测定糖化酶活力新方法[J].河北省科学院学报，1997，(2):35-39.

[13] 王成涛,张婵,尹胜,等.儿茶酚对运动发酵单胞菌抗氧化防御体系的影响[J]，中国食品学报,2014,14(8):21-26.

[14]中国轻工业联合会. GB/T 13662-2008 黄酒[S].北京:中国标准出版社, 2008.

(责任编辑：翁志辉)

Extraction Technology of Saccharifying Enzyme and Detection Method of Saccharification Ability of Qu of Fujian Rice Wine

LIN Xiao-jie1，2, LIANG Zhang-cheng1，2, HUANG Fei1，2,REN Xiang-yun1，2, LIN Xiao-zi1，2, HE Zhi-gang1，2*

(1.InstituteofAgriculturalEngineeringTechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences，FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou，Fujian350013，China；2.FujianKeyLaboratoryofAgriculturalProduct(Food)Processing,Fuzhou，Fujian350013,China)

Effects of different solid-to-liquid ratio, extraction temperature and extraction time on the saccharification ability of enzyme extraction of Qu of Fujian rice wine were studied; at the same time, iodometric method, DNS method and Fehling reagent method were compared; and the saccharification ability of Qu of Fujian rice wine were tested and verified. In conclusion, the optimal extraction conditions of saccharifying enzyme : the solid-to-liquid ratio (m/V) of 1 g ∶ 25 mL, the powder of Qu of Fujian rice wine solved in buffer solution and shaked immediately，detected the filtrate. Both methods method could be applied in the determination of saccharification ability in Hongqu glutinous rice wine, and there was no statistical difference. Iodometric method could be selected if it is small sample quantity; DNS method could be selected if it is big sample quantity. During Hongquglutinous rice winetest and verify, the result of detectionpaint a similar picture withthe wine yield.

Qu of Fujian rice wine; saccharifying enzyme; saccharification ability

2016-04-11初稿；2016-07-20修改稿

林晓婕(1982-)，女，硕士，主要从事农产品加工及食品发酵研究

*通讯作者：何志刚(1964-),男,研究员,主要从事农产品贮藏与加工研究(E-mail:njgzx@163.com)

福建省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1015-4，2014R1015-5，2016R1014-7)、福建省农业科学院青年人才创新基金C类(2015QC-9)

TS 261.2

A

1008-0384(2016)08-892-05

林晓婕，梁璋成，黄 飞，等.红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优[J].福建农业学报，2016，31(8)：892-896.

LIN X-J，LIANG Z-C，HUANG F，et al.Extraction Technology of Saccharifying Enzyme and Detection Method of Saccharification Ability of Qu of Fujian Rice Wine [J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：892-896.