文心兰杂种胚培养研究

罗远华，黄敏玲，林 兵，叶秀仙，钟淮钦

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院花卉研究中心，福建 福州 350013；3.福建省特色花卉工程技术研究中心，福建 福州 350013)



文心兰杂种胚培养研究

罗远华1，2，3，黄敏玲1,2，3*，林 兵1，2，3，叶秀仙1，2，3，钟淮钦1，2，3

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院花卉研究中心，福建 福州 350013；3.福建省特色花卉工程技术研究中心，福建 福州 350013)

以文心兰‘红狐狸’与‘百万金币’杂种胚为外植体，采用种胚→原球茎→完整植株→移栽的途径，探讨植物生长调节剂、有机添加物等因素对文心兰杂种胚萌发、原球茎分化、生根等各阶段的影响，建立文心兰杂种胚离体培养及植株再生技术。结果表明，适宜萌发的培养基为花宝+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+CM 150 g·L-1+AC 1.0 g·L-1+蔗糖20 g·L-1，培养90～100 d后相对萌发率为155.6%，原球茎基本不增殖，利于叶的分化；适宜分化的培养基为花宝+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+马铃薯泥 150 g·L-1+AC 1.0 g·L-1+蔗糖25 g·L-1，分化率显著最高，为87.8%，添加马铃薯泥能显著提高分化率，促进芽苗的粗壮；将分化的芽苗在花宝+NAA 0.2 mg·L-1+马铃薯泥 150 g·L-1+AC 1.5 g·L-1+蔗糖25 g·L-1培养基上培养40 d后生根率为100%，且根系发达，植株健壮；生根苗炼苗后以水苔作为基质，移栽成活率达91.7%。

文心兰；杂种胚；胚培养；原球茎

文心兰Oncidiumspp.又名“金蝶兰”、“舞女兰”或“瘤瓣兰”等，原产中南美洲的热带和亚热带地区，其花型奇特、花色丰富、观赏期长，具有极高的观赏价值和经济价值。国内从20世纪90年代初开始引种和栽培文心兰，目前栽培面积已初具规模。随着国内花卉消费水平的不断提高，对文心兰的需求不断增加，但滞后的品种和技术创新严重影响了我国文心兰产业的发展。

杂交育种是文心兰最主要的育种手段，但文心兰杂交亲合力差，难以获得杂种胚，育种进程缓慢[1]。目前，国内在文心兰杂交育种方面虽有部分研究，但研究缺乏系统性，且育成的新品种极少[2-4]。笔者在之前的研究中获得了14个文心兰杂交结荚组合[5]，因此急需建立文心兰杂种胚培养技术，从而快速获得杂种F1材料。目前国内在建兰、大花蕙兰、蝴蝶兰等兰花的杂种胚培养方面有部分研究[6-8]，但有关文心兰杂种胚培养的研究尚未见报道。因此，本研究以文心兰‘红狐狸’与‘百万金币’杂种胚为试验材料，对杂种胚培养、原球茎分化、芽苗生根及炼苗移栽等关键技术进行研究，旨在建立文心兰杂种胚培养及植株再生技术，为快速获得文心兰杂种F1材料及培育出文心兰新品种奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为来自福建省农业科学院花卉研究中心兰花资源圃杂交新组合文心兰‘红狐狸’(BeallaraMarfitch ‘Howards Dream’)ב百万金币’(OncidiumSweet Sugar ‘Million Dollar’) 的成熟杂交蒴果。

1.2 试验方法

1.2.1 蒴果的消毒与杂种胚接种 采摘人工杂交授粉后成熟(授粉后160～180 d)但未开裂的蒴果，用75%的酒精擦洗蒴果表面，并用手术刀削除病斑，在超净工作台上用1 g·L-1HgCl2水溶液浸泡灭菌10 min，无菌水冲洗3次后，风干表面水分，将蒴果切开取出杂种胚(图1-A)，等量(如1 g种胚用10 mL无菌水混匀，每瓶1 mL)接种在培养基表面。

1.2.2 培养条件 以花宝(Hyponex)为基本培养基，均添加 7.0 g·L-1琼脂粉作固化剂，pH值为5.4～5.6。培养基配制分装后于121℃压力蒸汽灭菌20 min，冷却后使用。培养温度为(25±2)℃、杂种胚萌发光照强度500～1 000 lx、原球茎分化与壮苗培养光照强度1 000～1 500 lx、生根培养光照强度1 500～2 000 lx、光照时间12 h·d-1。

1.2.3 杂种胚的萌发 以花宝+蔗糖 20 g·L-1+AC 1.0 g·L-1+椰汁(CM，取新鲜椰汁用双层纱布过滤后使用) 150 g·L-1为基本培养基，添加不同质量浓度6-BA(0、0.5、1.0 mg·L-1)与NAA(0、0.05、0.1、0.2 mg·L-1)，共7个处理3次重复，每处理接种3瓶，培养一段时间后观察6-BA和NAA组合对种胚萌发的影响，统计相对萌发率，筛选出适宜的萌发培养基。

1.2.4 原球茎分化培养 以萌发的原球茎为材料，接种在2种培养基，(1)花宝+蔗糖 25 g·L-1+AC 1.0 g·L-1+马铃薯泥(马铃薯洗净后蒸熟，去皮后用搅拌机打烂)150 g·L-1为基本培养基，添加不同质量浓度6-BA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1)与NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1)，共9个处理3次重复，每处理接种原球茎12个，培养60 d后观察6-BA和NAA组合对原球茎分化的影响；(2)以花宝+6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA0.1 mg·L-1+蔗糖 25 g·L-1+AC 1.0 g·L-1为基本培养基，分别添加150 g·L-1的CM、马铃薯泥及香蕉泥(去皮后用搅拌机打烂，用纱布挤压过滤)，共3个处理3次重复，每处理接种原球茎12个，培养60 d后观察不同有机添加物对分化的影响，统计增殖率、分化率，筛选出适宜的分化培养基。

1.2.5 生根及移栽 将分化出的芽苗接种到生根培养基中，以花宝+马铃薯泥150 g·L-1+蔗糖25 g·L-1+ AC 1.5 g·L-1为基本培养基，添加不同浓度NAA(0、0.1、0.2、0.4 mg·L-1)，共4个处理3次重复，每处理接种12株，生根培养60 d后统计生根率、平均根数、平均根长等，筛选出适宜的生根培养基。移栽前在温室中开盖驯化，经洗苗、消毒后用水苔种植，统计成活率。

1.3 数据处理

相对萌发率=(添加6-BA和NAA培养基萌发的原球茎数/未添加6-BA和NAA培养基萌发的原球茎数)×100%，未添加6-BA和NAA培养基相对萌发率记作100%；增殖率=(原球茎总数/接种原球茎数)×100%；分化率=(具有2～3片展开叶的芽苗数/接种原球茎数)×100%；生根率=(生根苗数/接种苗数)×100%；平均根数=总根数/总苗数；平均根长=总根长/总根数。

试验数据统计与分析采用Excel和SPSS软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同生长调节剂组合对文心兰杂种胚萌发的影响

成熟的蒴果内杂种胚为白色或褐色。从表1中可以看出，添加6-BA与NAA能缩短文心兰杂种胚萌发时间约30 d，提高相对萌发率39.3～80.9%，差异显著。添加1.0 mg·L-16-BA时相对萌发率显著高于其他组合，观察发现是高浓度的6-BA抑制了原球茎顶端叶的分化，促进了原球茎的增殖，新增殖的部分作为种胚萌发的原球茎进行了统计引起的，增殖出的原球茎颜色浅绿，具水渍状，易玻璃化，不利于分化成苗；添加0.5 mg·L-16-BA时原球茎基本无增殖，原球茎颜色深绿、饱满，顶端叶的分化较多。NAA对原球茎的分化具有重要的作用，添加0.05 mg·L-1时分化慢，但较高浓度时(0.2 mg·L-1)原球茎易玻璃化而降低分化能力。因此，文心兰杂种胚萌发适宜的培养基为花宝+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+CM 150 g·L-1+AC 1.0 g·L-1，培养90～100 d后无褐化现象，相对萌发率为155.6%，萌发形成的原球茎颜色绿，基本不增殖，且顶端叶的分化多(图1-B)。

表1 不同生长调节剂组合对杂种胚萌发的影响

注：同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平为(P<0.05)。表2～4同。

2.2 原球茎的分化培养

将萌发获得的原球茎，转接到不同分化培养基中进行分化培养。从表2中可以看出，较低浓度的6-BA配合NAA使用对原球茎的增殖与分化均有较大的影响。添加0.2 mg·L-16-BA时，促进原球茎的增殖，但抑制分化出芽，与其他组合相比差异显著；添加0.1 mg·L-16-BA时，原球茎增殖少，分化率高，其中配合0.1 mg·L-1NAA使用时分化率显著最高，为87.8%，且出根少，芽苗粗壮；6-BA质量浓度较低时(0.05 mg·L-1)虽然增殖率低，但分化率不高。NAA质量浓度较低时(0.05 mg·L-1)叶的生长较慢，较高时(0.2 mg·L-1)易诱导出根，不利于芽苗的生长。以上结果说明文心兰杂种胚萌发的原球茎对较低质量浓度的6-BA和NAA较为敏感，适合的6-BA和NAA质量浓度及配比能决定原球茎保持增殖或走向分化。添加CM、马铃薯泥以及香蕉泥对原球茎的增殖与分化有不同的影响，增殖效应为CM>香蕉泥>马铃薯泥，但差异不显著；分化效应为马铃薯泥>香蕉泥>CM，马铃薯泥与CM差异显著。生长表现为马铃薯泥芽苗粗壮，CM则较细弱，香蕉泥在后期不利于芽苗的强健。综上所述，适宜原球茎分化的培养基为花宝+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+马铃薯泥 150 g·L-1+AC 1.0 g·L-1，分化率高，芽苗粗壮。

表2 不同生长调节剂组合对原球茎分化的影响

表3 不同有机添加物对原球茎分化影响

Table 3 Effect of organic compounds on protocorm differentiation

有机添加物/(g·L-1)增殖率/%分化率/% 生长表现150CM123.3a77.8b增殖较多,分化较少,芽苗较细弱150马铃薯泥116.7a87.8a增殖少,分化多,芽苗粗壮150香蕉泥118.9a82.1ab增殖较少,分化较多,芽苗后期长势较差

2.3 生根培养

将分化的芽苗接种在生根培养基中，经过40 d的培养(表4)在不添加NAA的培养基上，也有较高的生根率，可达89.7%，但根系不发达。添加0.1～0.4 mg·L-1的NAA促进根系的诱导，生根率均达到100%，平均根数增多，根长增加，差异显著。较高量的NAA(0.4 mg·L-1)在诱导生根的同时容易诱导出原球茎，且根系膨大，不利于苗的强健。比较而言，添加0.2 mg·L-1NAA适宜根的诱导及植株的生长，平均根数为7.2条，平均根长为2.6 cm，植株健壮(图1-C)。研究还发现杂种胚获得的植株在株高、叶长及叶形等性状上具有明显的差别(图1-D)，这可能是杂种F1材料性状分离引起的。

表4 不同NAA浓度对生根的影响

2.4 炼苗移栽

为了增强试管苗适应外界的能力，提高移栽成活率，在移栽前将试管苗在温室内(遮光75%，温度20～28℃)炼苗7～10 d，开盖后再炼苗2～3 d。移栽时先将试管苗小心取出，用自来水洗净培养基(图1-D)，再用1 g·L-1多菌灵水溶液浸苗消毒3～5 min，取出沥干明水，用已处理好的水苔包住整个根系植于1.5寸白色育苗杯中，移栽后保持温度为22～28℃、湿度为70%～80%、光照强度为8 000～10 000 lx, 避免阳光直射，注意通风和喷施水肥，3～4周后新根长出，成活率达91.7%(图1-E)。

3 讨论与结论

花宝培养基在兰科植物种子(胚)培养中应用十广泛[9-12]，本研究表明花宝培养基适宜文心兰杂种胚的培养。萌发率高、原球茎不增殖而直接分化成苗，是兰科植物杂种胚培养的理想途径。本研究中添加6-BA与NAA能缩短杂种胚萌发时间约30 d，显著提高萌发率，这与邱翊恬[13]的报道一致。本研究得出添加0.5 mg·L-16-BA与0.1 mg·L-1NAA适宜杂种胚的萌发，不仅萌发率高，增殖率低，且利于顶端叶的分化。本研究还发现文心兰杂种胚萌发的原球茎对6-BA和NAA较为敏感，较低量的(0.05～0.2 mg·L-1)配比就能决定原球茎保持增殖或走向分化，说明6-BA与NAA是影响文心兰杂种胚萌发、原球茎形态建成的重要因子，这与培养蝴蝶兰[14]、文心兰[15]的类原球茎(PLB)的结果相一致。

研究表明有机添加物对植物细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用[16]，常用于兰花组织培养。研究表明添加新鲜椰汁能促进蝴蝶兰PLB的增殖[17]，增殖效果CM最好，其次为马铃薯、香蕉[14]，但也有研究[18]认为香蕉汁对虎头兰原球茎的增殖效果优于马铃薯汁。本研究发现CM、马铃薯泥、香蕉泥对文心兰杂种胚萌发的原球茎的增殖效果差异不显著；但分化效应马铃薯泥效果最好，其次为香蕉泥、CM，且马铃薯泥与CM差异达显著水平。有机添加物富含的微量元素、活性物质和生长激素种类与含量等因产地、品种、成熟度等的不同存在差异，还能与外源激素产生互作效应，这可能是不同研究存在差异的主要原因。此外添加香蕉泥在后期不利于芽苗的强健与根系的生长，与何松林[19]的研究结果一致，这可能与添加香蕉泥后培养基易酸化有关。

文心兰杂交结实率低，而且大多杂交蒴果中无杂种胚，或含量极少，或发育不完全[20]。因此，提高杂种胚萌发率、缩短萌发时间、加快原球茎生长与分化速度，在最短时间内获得杂种F1植株，能加快育种进程。采用本研究建立的文心兰杂种胚培养方法，已成功培养获得6个文心兰杂交组合F1材料。此外，文心兰杂种F1植株一般移栽2～3年后才进入花期，因此在移栽后苗期阶段通过分子辅助手段鉴定杂种真实性及分析其遗传变异规律，能为杂交后代的早期筛选提供有效的手段，这部分内容还在进一步研究中。

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(责任编辑：黄爱萍)

Embryo Culture for Orchid Hybrid CrossedbetweenBeallaraMarfitch andOncidiumSweet Sugar

LUO Yuan-hua1，2，3, HUANG Min-ling1,2，3*, LIN Bing1，2，3, YE Xiu-xian1，2，3, ZHONG Huai-qin1，2，3

(1.CropResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China;2.FlowerResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China;3 .FujianEngineeringResearchCenterforCharacteristicFloriculture,Fuzhou,Fujian350013,China)

Embryos of the orchidhdyridcrossed betweenBeallaraMarfitch Howards Dream andOncidiumSweet Sugar Million Dollar were usedas explants in a cultivation experimentation to study the effects of various growth regulators and organic additives on its germination, protocorm differentiation, and rooting,from the formations of embryos and protocorms to the development and transplantation of the plants. Aculture medium consisting of Hyponex, 6-BA 0.5 mg·L-1, NAA 0.1 mg·L-1, CM 150 g·L-1, AC 1.0 g·L-1, and sugar 20 g·L-1provided an optimal relative embryo germination rate of 155.6% for the hybrid after 90-100 d of cultivation. In addition, the medium inhibited the protocorm proliferation, and thus, encouraged its differentiation subsequently. For the protocorm differentiation, a medium containing Hyponex,6-BA 0.1 mg·L-1, NAA 0.1 mg·L-1, mashed potato 150 g·L-1, AC 1.0 g·L-1, and sugar 25 g·L-1rendered asignificantly higher rate of 87.8% thanother media tested. The addition of mashed potatoes in the medium significantly increased the differentiation ratepromoting the seedling growth. Vigorously growing plantlets were, then, transferred to a medium containing Hyponex,NAA 0.2 mg·L-1,mashed potato 150 g·L-1, AC 1.5 g·L-1, and sugar 25 g·L-1for a complete and well-developed rooting on the healthy and well-developed plantlets with 40 d of cultivation.After an initial adaptation period, the survival rate of the transplanted seedling sreached 91.7% on peat moss.

oncidium; hybrid embryo; embryo culture; protocorm

2016-03-14初稿；2016-05-09修改稿

罗远华(1981-)，男，硕士，助理研究员，主要从事兰花栽培与育种研究(E-mail：luoyh426@163.com)

*通讯作者：黄敏玲(1960-)，女，研究员，主要从事花卉育种与生物技术研究(E-mail：huangml168@163.com)

福建省林业科学研究项目[闽林种站(2013)42号]；福建省农业科学院导师制青年科技创新基金项目(2013DQA-4)

S 682.31

A

1008-0384(2016)08-

罗远华，黄敏玲，林兵，等.文心兰杂种胚培养研究[J].福建农业学报，2016，31(8)：839-843.

LUO Y-H，HUANG M-L，LIN B，et al.Embryo Culture for Orchid Hybrid CrossedbetweenBeallaraMarfitch andOncidiumSweet Sugar [J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：839-843.