杜鹃兰类原球茎快速增殖研究

陈 芳， 覃顺旺， 王跃华， 陈 燕， 杨芸燕， 廖海松

(成都大学， 四川 成都 610106)

杜鹃兰(Cremastraappendiculata(D.Don) Makino)是兰科中多年生药用草本植物[1]，用干燥假鳞茎入药，夏、秋两季采挖[2]。杜鹃兰是生药山慈菇的主流品种，山慈菇是中药里常用的一味，其味甘，性凉，根据国内外文献报道的化学成分主要有黄酮类[3]、生物碱类、菲类、联苄类等80余种化合物[4]，具有清热解毒，化痰散结的功效[5]。现代临床上配伍应用于抗肿瘤、抗菌、降压、抗痛风[6]、致突变性、抗血管生成活性、毒覃碱M 3受体阻断作用[7]，国外的一些学者们通过活性筛选从杜鹃兰植株中分离得到四个化合物，其中的一个化合物具有较强的抗血管生成的活性[8]，在市场上具有很大的开发潜力。鉴于杜鹃兰巨大的药用价值，市场需求量大，需要快速获得杜鹃兰类原球，为种苗繁殖提供材料。原球茎在继代过程中能不断分裂增殖产生新的类原球茎，增殖时在原球茎表面或内部的薄壁组织中的一些核大、质浓的胚性细胞分裂后形成胚性细胞团，胚性细胞团可继续发育形成类原球茎[9]。类原球茎现已经作为许多兰科植物的植株再生、细胞工程以及遗传转化的主要材料或受体[10]，通过类原球茎增殖是杜鹃兰属植物快速繁殖的有效途径。本研究利用植物组织培养技术，对杜鹃兰类原球茎快速增殖的影响因素进行研究，建立较完整的增殖体系。

1 材 料

杜鹃兰(Cremastraappendiculata(D.Don) Makino)种子经过无菌萌发后形成的原球茎，放入B 5基本培养基中培养30 d后形成类原球茎，作为外植体。

2 方 法

2.1 基本培养基

在无菌条件下，从培养瓶中选取生长良好的白色或嫩绿色的杜鹃兰类原球茎，用手术刀切割成适宜大小后，转入不同基本培养基(MS、1/2 MS、1/4 MS、B 5、N 6、KC)中进行类原球茎增殖研究，在温度为20 ℃、光照强度为1 500～2 000 lx、光照12 h·d-1的条件下培养，观察类原球茎整个增殖过程，培养50 d后统计类原球茎增殖倍数。

2.2 类原球茎增殖条件优化

选取萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，NAA)(A)、活性炭(B)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)(C)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)(D)作为四因素，分别设置3个浓度，见表1，根据正交试验设计，每个因素对应的浓度见表3，共9组试验，3个重复。在温度为20 ℃，光照强度为1 500～2 000 lx，光照12 h·d-1的条件下培养，50 d后统计类原球茎增殖情况。

表1 L9(34)类原球茎增殖因素和水平表

2.3 类原球茎增殖生长曲线

选取生长良好的白色或嫩绿色类原球茎，切割为适宜大小后，转接入B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1+土豆泥30.0 g·L-1的培养基中，置于培养室中培养，观察并记录类原球茎生长情况，每隔5 d取出称重一次，记录每瓶类原球茎重量，确定杜鹃兰类原球茎增殖培养的最佳周期。

2.4 数据处理

本试验设计与数据处理采用Microsoft Office Excel 2010软件与正交助手Ⅱ软件完成。

类原球茎平均增殖倍数=(增殖后类原球茎重量-接种重量)/接种重量。

3 结果与分析

3.1 基本培养基对杜鹃兰类原球茎增殖的影响

将生长良好的白色或嫩绿色类原球茎转接入不同基本培养基中，培养50 d后，观察并记录类原球茎增殖情况，结果见表2。

在植物快繁研究中，基本培养基的筛选极其重要。从表2和图1可知，杜鹃兰类原球茎快速增殖的最佳基本培养基为S 4，即B 5培养基，培养45 d后，平均增殖倍数为2.12倍。观察发现，类原球茎在S 1培养基中，增殖速度慢，褐化情况严重，正常生长的类原球茎呈白色和嫩绿色；在S 2和S 3培养基中，增殖速度较S 1快，呈白色，新生类原球茎体积较小；在S 4培养基中，增殖速度最快，呈白色或嫩绿色，长势最佳；在S 5和S 6培养基中，褐化死亡和部分呈水渍状，增殖速度较慢。通过实验结果可知，S 1、S 2、S 3平均增殖倍数明显低于S 4，分析发现，S 1培养基中含有较高的铵态氮与高水平的盐溶液，但杜鹃兰植物在S 1培养基中类原球茎增殖效果不佳，可降低铵态氮与盐含量，使增殖速度加快，S 4培养基中仅含硝态氮，且无机盐浓度较低，最适合杜鹃兰植物类原球茎的增殖，与毛堂芬等[11]的研究结果一致。综上，杜鹃兰类原球茎增殖的最佳基本培养基为B 5培养基。

图1 不同基本培养基对杜鹃兰植物类原球茎增殖的影响Fig.1 Effects of different basic media on proliferation of C. appendiculata protocorm-like bodies

表2 不同基本培养基对杜鹃兰植物类原球茎增殖的影响

3.2 杜鹃兰植物类原球茎增殖条件优化

根据正交试验设计，将生长良好的杜鹃兰植物类原球茎转接入添加了NAA、活性炭、IBA和IAA的B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+土豆泥30.0 g·L-1的培养基中，接种前称重，培养50 d后取出除去培养基后再次称重，统计类原球茎增殖倍数。结果见表3和表4。

由表3可知，未添加细胞生长素和活性炭的Y 1培养基类原球茎增殖效果最差，培养过程中易褐化死亡，类原球茎长势差；在添加了细胞生长素和活性炭的Y 2～Y 9培养基中，类原球茎增殖速率明显高于Y 1培养基，其中Y 9培养基增殖速度最快，类原球茎为白色或嫩绿色，体积大，说明细胞生长素和活性炭在杜鹃兰植物类原球茎增殖过程中至关重要，这和吴彦秋等[12]对杜鹃兰原球茎增殖研究中一致。通过极差分析可知，4个因素对杜鹃兰植物类原球茎增殖的影响程度依次为A>B>D>C，即培养基中NAA影响最大，活性炭次之，然后是IAA，影响最小的是IBA。杜鹃兰植物类原球茎增殖的最佳组合为A 3 B 3 C 2 D 3，即B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1+土豆泥30.0 g·L-1。

表3 类原球茎增殖直观分析

由表4可知，四个因素仅因素A达到显著水平，因素NAA检验值F=31.74，F0.05=19.00，F0.01= 99.00，检验值F0.05

表4 方差分析结果

图3 接入培养基的类原球茎(a)和增殖培养45 d后的类原球茎(b) Fig.3 Comparison of protocorm-like bodies cultured in culture medium (a) and protocorm-like bodies cultured for 45 days after proliferation (b)

3.3 杜鹃兰植物类原球茎增殖生长曲线

将生长良好的白色或嫩绿色类原球茎从培养瓶中取出，在无菌条件下切割，转接入培养基中，置于培养室中培养，定期称重，记录类原球茎生长情况。结果见图2和图3。

图2 杜鹃兰类原球茎增殖生长曲线Fig.2 Procorm-like bodies proliferation and growth curve of C. appendiculata

从图2可知，将生长情况良好的杜鹃兰植物类原球茎切割后转接入培养基中，培养0～15 d处于延迟期，在此阶段，由于植物细胞进入新环境，是适应新环境和促进切割伤口愈合的时期，因而杜鹃兰类原球茎重量变化极小；15～45 d为对数生长期，在该时期，细胞迅速增大与分裂增殖，体积与数量快速增加，因而杜鹃兰类原球茎重量快速增加；45～60 d处于稳定期，该时期杜鹃兰类原球茎总重量相对稳定，培养基中营养物质含量经过对数生长期的大量消耗后大幅度下降，产生的不利于细胞生长的毒性物质也增多，之后进入衰亡期[13]。结果表明，杜鹃兰类原球茎细胞增殖生长曲线为“S”型，类原球茎增殖的最佳培养周期为45 d，杜鹃兰植物类原球茎增殖倍数可达8.20倍。

通过观察试验过程发现，杜鹃兰类原球茎在增殖培养7 d后，类原球茎上开始长出白色绒毛，之后，绒毛迅速生长，培养15 d后开始有新的白色类原球茎长出，继续培养，白色类原球茎体积增大，颜色由白色转变为嫩绿色，培养20 d后，白色类原球茎开始大量长出，直到培养45 d后，杜鹃兰类原球茎增殖速度逐渐变缓。杜鹃兰植物类原球茎增殖过程中增殖速度与培养初期生长的白色绒毛有关，绒毛越丰富，增殖速度越快，可能与绒毛辅助进行水分、氧气与营养成分的吸收有关。

4 结论与讨论

杜鹃兰植物通过类原球茎增殖快速繁育是规模化生产杜鹃兰植物组培苗的重要途径之一，类原球茎的增殖速率和活力状况对杜鹃兰快繁技术体系至关重要。本研究筛选了基本培养基和不同激素浓度，绘制出类原球茎增殖生长曲线，筛选出最适宜杜鹃兰类原球茎增殖的条件。结果表明，选取生长良好的白色或嫩绿色类原球茎，转接入B 5+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1+1.0 g·L-1活性炭+30.0 g·L-1土豆泥培养基中，置于培养室中培养，培养周期为45 d，增殖倍数最高达8.20倍。

在植物组织培养中，外植体极易出现褐化，其中杜鹃兰植物的类原球茎就极易褐化而死亡。戴莹等[14]在药用植物组织培养褐化现象的研究进展中提到，褐化主要分为由酶引起的褐化反应和无酶引起的褐化反应两种情况。本研究中，杜鹃兰植物类原球茎的褐化主要是酶促褐化，为此减少褐化是整个类原球茎增殖的核心。首先选用活力高幼嫩且健壮的白色或嫩绿色的类原球茎，采用减少伤口的接种方式，减少酚类物质的释放，并将伤口部位插入培养基中，隔绝氧气，减少酶的产生；其次是适宜的细胞分裂素和生长素的浓度比例，对褐化有明显的抑制作用[15]；最后是在培养基中添加适宜浓度的活性碳，活性碳可以吸附植物在生长过程中释放的酚类物质[16]。