‘洛阳红’牡丹腋芽培养过程中褐化的防止技术研究

张庆瑞，赵国栋

（1.河南林业职业学院，河南洛阳 471002；2.洛阳国家牡丹园，河南洛阳 471011）

牡丹（Paeonia suffruticosa）是中国十大名花之一，其花型硕大、色泽艳丽、雍容华贵，自古以来，深受人们的喜爱。我国栽培牡丹历史悠久，除了采用传统的嫁接和分株方法进行繁殖外，近年来，组织培养技术也取得了不小的进展，但在牡丹组培过程中，外植体褐化现象严重，严重影响愈伤组织的诱导、继代增值培养及根系的诱导[1-4]。笔者以‘洛阳红’牡丹的腋芽为外植体，通过添加不同的物质，探索防止组织培养过程中腋芽褐化的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验以‘洛阳红’牡丹的腋芽为材料，2 月份采集牡丹腋芽，流水清洗后，经75%酒精和0.1%升汞消毒。培养基中添加3%蔗糖、0.75%的琼脂，pH 5.8。培养室温度控制在25℃，光照强度为1 500~2 000 Lux，光照时数每天10 h。

1.2 试验方案

1.2.1 不同天然添加物浓度对‘洛阳红’腋芽褐化的影响。以1/2MS 为基本培养基，在培养基中添加不同浓度的马铃薯汁（0，100，200，300 g/L），椰汁（0，100，200，300 g/L），研究不同天然添加物对‘洛阳红’腋芽褐化的影响。每处理7 瓶，每瓶接种3 个腋芽，14 d 后观察统计结果。

1.2.2 固体培养基、液体培养基、活性炭对‘洛阳红’腋芽的影响。以1/2MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L 为基本培养基。把培养基分液体、固体、液体+活性炭、固体+活性炭的不同处理，用0.75%的琼脂固化，观察固体培养基、液体培养基、活性炭对‘洛阳红’腋芽的影响。每处理7 瓶，每瓶3 个材料，14 d 后观察统计结果。

1.2.3 不同的预处理对‘洛阳红’腋芽褐化的影响。同样以1/2MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L 为基本培养基。腋芽接种前采用4 种不同的预处理，分别是除鳞片、冷处理（4℃下储存3 d）、热处理（45℃下90 s）、水冲洗（水冲洗5 h），研究不同预处理对‘洛阳红’腋芽褐化的影响。每处理7 瓶，每瓶 3 个，14 d 后观察统计结果。

1.3 褐化程度的分级标准

将牡丹腋芽褐化程度分为6 个等级，从重到轻依次为：5 级，极严重褐化，整个外植体变为黑色；4 级，严重褐化，整个外植体变为棕黑色；3 级，中度褐化，外植体70%以上部分变色；2 级，轻度褐化，外植体两端变色较轻；1级，轻微褐化，基本上没有褐化；0 级，无褐化，没有褐化。褐化率和综合褐化程度采用下式计算：

褐化率=褐化数量/接种数量×100%

综合褐化程度=（褐化等级×该等级的褐化数量+褐化等级×该等级的褐化数量）/褐化总数

2 结果与分析

2.1 不同天然添加物浓度对‘洛阳红’腋芽褐化的影响

从表1 可以看出，添加椰汁的培养基，综合褐化程度都比对照低，其中200 和300 g/L 的椰汁的处理，褐化程度显著低于对照，说明椰汁起到了一定的控制褐化的作用；添加马铃薯汁的培养基对褐化的控制效果不仅不明显，还有加重的现象。

表1 天然添加物对‘洛阳红’腋芽褐化的影响

2.2 琼脂及活性炭对‘洛阳红’腋芽褐化的影响

从表2 可以看出，未添加活性炭时，液体培养基和固体培养基相比，液体培养基培养的腋芽褐化程度显著低于固体培养基，说明液体培养基能起到控制褐化的作用。添加活性炭后，无论是液体培养基还是固体培养基，褐化率及褐化程度显著降低，说明活性炭对控制褐化起到了有效的作用。

表2 琼脂及活性炭对‘洛阳红’腋芽褐化的影响

2.3 不同预处理对‘洛阳红’腋芽褐化的影响

从表3 可以看出经过去除鳞片与热处理的的腋芽，达到了较好的控制褐化的目的，而经过冷处理与水冲洗的褐化率较高，褐化程度较大。

表3 不同的预处理对‘洛阳红’腋芽褐化的影响

在第21 天观察时，去除鳞片与热处理的腋芽长高2~3 cm，而冷处理中只有4 个长势良好，2 个没有褐化，其他均没有发芽，在水冲洗处理中，有12 个长势良好，3 个没有褐化。

3 结论与讨论

在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质能够很快扩散，从而减轻了对外植体的伤害[5]，因此液体培养基和固体培养基相比，液体培养基能起到控制褐化的作用。添加活性炭的培养基褐化率及综合褐化程度显著降低，说明活性炭对控制褐化起到了有效地控制作用。添加活性炭的原理是活性炭能够吸附培养基中的有害物质，如琼脂中所含的杂质，培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛[6]。

椰汁不仅可以在组织培养过程中提供营养，还可以防止褐化，已广泛应用到蝴蝶兰、文心兰等花卉的组织培养中[7-8]。该次研究发现，在牡丹腋芽培养时，加入椰汁，可明显减低褐化指数，起到控制褐化的作用。接种前对腋芽除鳞片与热处理的腋芽，可达到控制褐化的目的，而经过冷处理与水冲洗的反而使褐化率提高，褐化程度增大。