铁皮石斛原球茎富硒悬浮培养条件优化

韩素菊， 梅闯

（绵阳师范学院城乡建设与规划学院，四川 绵阳 621000）

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科多年生附生草本植物。1992年铁皮石斛被收载为濒危植物，主治热病津伤、口干烦渴、阴虚火旺、目暗不明等症。临床应用上铁皮石斛具有增强机体免疫力、抗氧化、抗疲劳、降低血压、降血糖、抗肿瘤等方面[1-5]的独特功效。现有研究表明，人体与动物体内硒元素的缺乏与多种疾病的产生有一定的关系，而含硒的各类产品对于这些疾病可以起到缓解或治愈作用[6]。硒具有抗癌、抗氧化的功效，还具有改善免疫系统，增强免疫细胞的生物学功能[7]。无机硒相较于有机硒的安全性和吸收率要低，当前主要是依靠植物转化技术的途径来获取有机硒，而通过生物转化有利于提高有机硒的含量，最终进入食物链，可供人或动物食用[8-11]。另外对植物适量的施硒同时会促进其生长发育并提高产品质量[12-13]。

利用悬浮培养技术，可以直接从培养物中生产次级代谢产物，这些次生代谢产物具有很多生物活性，是植物药的重要成分。本研究对富硒悬浮培养生产石斛碱、多糖等有用次生代谢产物进行探讨，得出适合铁皮石斛富硒悬浮培养细胞生长和石斛碱、多糖积累的优化悬浮培养条件，以期为铁皮石斛富硒悬浮培养工厂化生产有效药用成分提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用原球茎是将铁皮石斛成熟未开裂的蒴果经种子经组织培养得到的材料。铁皮石斛种子来自于浙江天目山铁皮石斛示范基地。

1.2 试验方法

1.2.1 疏松原球茎的诱导 将铁皮石斛原球茎分别继代于含不同含量6-BA、NAA，pH5.8的固体MS培养基中。培养温度为（25±2）℃，光照时间为12 h，光照强度为2 000 lx。在继代3次之后，将生长良好、大小均一且结构疏松的原球茎，继代到装有30 mL培养基的100 mL三角瓶中进行悬浮培养，培养液与培养疏松原球茎一致，只是不加琼脂。置于恒温振荡器中培养，温度（25±2）℃，光照时间为12 h，光照强度2 000 lx，转速 110 r·min-1。

1.2.2 悬浮培养接种量的确定 在超净工作台上称取1、2、3、4、5 g生长良好、大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎，接种到培养液中，每组5瓶,重复3次。置于恒温振荡器上进行培养，30 d后收获 ，测 定 其 鲜 重 (fresh weight，FW)、干 重 (dry weight，DW)、增殖系数。

1.2.3 悬浮原球茎增殖培养周期的确定 选择生长良好、大小均一且结构疏松的原球茎接种于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖培养基上，每瓶接种量为3 g，于恒温振荡器中进行培养生长，共培养51 d。重复3次。从培养第6天开始，每隔3 d随机收获5瓶，将收获的样品进行处理之后，按照测定方法，测定其鲜重(FW)、干重(DW)以及增殖系数，并绘制原球茎的生长曲线。

1.2.4 不同硒质量浓度对铁皮石斛原球茎各指标含量影响测定 将生长良好、大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎分别接种到添加不同Na2SeO3含量（硒含量分别为0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·L-1）的 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH为5.8液体培养基中。每瓶接种量为3 g，每个处理接种5瓶，根据前期悬浮原球茎增殖培养周期，在恒温振荡器中培养33 d之后收获，用于测定各指标。

1.2.5 富硒悬浮培养原球茎生长曲线及各指标测定 选生长良好、大小均一且结构疏松的铁皮石斛原球茎接种于 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1Na2SeO3+30 g·L-1蔗糖，pH为 5.8的液体培养基中，每瓶接种量为3 g，于恒温振荡器中进行培养生长，观察其生长状态，共培养了39 d，从培养第3天开始，每隔3 d收获5瓶，重复3次。将收获的样品进行处理之后，按照测定方法，测定各指标含量并绘制各生理指标的变化曲线。

1.3 各指标测定方法

1.3.1 原球茎生长量测定 用不锈钢筛网过滤收集原球茎，蒸馏水清洗2次，再用滤纸吸收多余水分，称量得鲜重(FW)。把收获的原球茎置于105℃的恒温鼓风干燥箱中杀青30 min，之后60℃烘12～24 h至恒重，得到干重(DW)。增殖系数测定公式如下。

1.3.2 多糖和生物碱含量测定 采用改进的蒽酮-硫酸法[14-15]测定多糖含量，采用溴甲酚绿酸性染料比色法[16-18]测定生物碱含量。每组数据测定3次，取平均值。

式中，C为待测样品对应的标准曲线值（µg），VT为提取液总体积（mL），W为样品干重（g），VS为测定时加样量（mL），n为样品稀释倍数。

1.3.3 总蛋白质含量测定 利用分光光度法[19-20]测定总蛋白含量，重复3次取平均值。

式中，D280代表蛋白质提取液在280 nm处测得的吸光度，D260代表蛋白质提取液在260 nm处测得的吸光度，V代表将所有样品提取液稀释成测量液浓度后的总体积（mL），m代表样品质量（g）。

1.3.4 硒含量测定 用ICP-OES测定硒含量[21]。测定3次，取平均值。

1.4 统计分析

用Excel 2016统计数据，IBM SPSS Statistics 23软件对试验数据进行方差分析并进行重复检验（P＜0.05），数据分析结果以平均数±标准偏差来表示。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对疏松原球茎诱导的影响

植物激素的合理组合是获得疏松原球茎的关键，而获得生长良好，大小均一且结构疏松的细胞是植物细胞悬浮培养的基础。从表1中可以看出，添加不同激素含量的培养基所获得的铁皮石斛原球茎的生长情况存在较大的差别。在无激素的培养基中，原球茎褐化无法正常生长（图1-1）。当6-BA含量越高，诱导的原球茎就越紧密，且原球茎发绿，不适合细胞悬浮培养（图1-9、1-10）。6-BA 含量为 2.0 mg·L-1、NAA 含量为0.50 mg·L-1时，诱导的原球茎为浅黄绿色，质地疏松（图1-6）。试验表明，铁皮石斛疏松原球茎的最佳培养基为 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA。

图1 不同培养基对铁皮石斛原球茎稳定生长的影响Fig.1 Effect of different media on the growth of protocorms of Dendrobium officinale

表1 不同培养基对铁皮石斛原球茎生长的影响Table 1 Effect of different medias on the growth of protocorms of Dendrobium officinale

2.2 富硒悬浮培养条件的优化研究

2.2.1 接种量对原球茎增殖的影响 参照一般悬浮细胞培养时间周期并观察培养物，初次培养选择30 d后收获原球茎。由表2可知，接种量对原球茎增殖有显著影响，合适的接种量有利于原球茎的生长。当接种量大于4 g时，培养后期培养基中的营养物质不足以维持其正常生长，影响原球茎的继续增殖，此时原球茎的增殖系数反而会随着接种量的增加逐渐下降。而接种量太低也不利于原球茎增殖，接种量小于2 g时，增殖系数变低，生长速度缓慢。当接种量为3 g时，即为100 g·L-1时，生长量达到最大值，且细胞生长疏松。此时的增殖系数可达到最大值，为0.69。

表2 接种量对原球茎增殖的影响Table 2 Effect of different inoculating quantity on protocorms multiplication

2.2.2 培养天数对原球茎增殖系数的影响 为了观察原球茎的生长衰亡过程，此试验过程持续培养了51 d。在培养过程中，原球茎的干重、鲜重变化基本呈现先上升再平稳最后下降的趋势（表3）。在第6天到第18天期间，原球茎干重、鲜重迅速增加并在第33天时达到最大值。在第33天到39天期间，干重、鲜重基本上保持恒定，且都在第39天之后开始下降，此时原球茎开始褐化，并伴随部分衰亡，生长活跃程度逐渐减弱。试验显示铁皮石斛原球茎增殖培养周期最宜控制在33 d左右，可使其增殖系数达到最大，为2.86。

表3 培养天数对原球茎增殖的影响Table 3 Effect of different cultivated days on protocorm multiplication

2.2.3 富硒培养对原球茎生理指标及硒含量的影响 在MS液体增殖培养基中添加不同含量硒对原球茎进行富硒悬浮培养，根据前期原球茎生长周期，试验富硒培养在33 d后收获。由表4可知，不同硒含量对铁皮石斛原球茎的生长、多糖含量、生物碱含量以及总蛋白质含量有着不同的影响。当硒含量为0.05 mg·L-1时，原球茎富硒含量达到最大值，为4.01 mg·kg-1，且原球茎的增殖系数达到最大值，为1.95，多糖含量为29.07%，生物碱含量为0.025%，总蛋白质含量为27.21%，而且此时原球茎颗粒大小均一且饱满，生长良好，各生理指标含量最佳。而当硒含量大于0.10 mg·L-1时，原球茎的鲜重及增殖系数开始下降，且多糖、蛋白质、生物碱含量也降低，试验显示高含量的硒抑制了原球茎的生长，且原球茎内次生代谢类物质含量也在降低。在培养基中添加适量的硒可促进原球茎生长及提高原球茎的多糖及总蛋白质等的含量，提高原球茎品质，可以达到铁皮石斛原球茎富硒培养目标。

表4 硒含量对原球茎富硒含量、多糖、生物碱及总蛋白含量的影响Table 4 Effect of different selenium content on selenium-enriched content，polysaccharide content，alkaloid content and total protein content

2.3 最佳富硒含量下培养天数对原球茎各生理指标的影响

2.3.1 富硒原球茎生长曲线 为了观察富硒原球茎生长、衰亡过程，此次培养周期持续了39 d。铁皮石斛原球茎富硒悬浮培养的生长曲线如图2所示，原球茎的鲜重变化也呈现先上升后逐渐下降的趋势。在培养30 d时，鲜重达到最大，之后开始缓慢下降。与未富硒培养试验所得到的培养指标变化相比较，富硒培养对原球茎生长的促进作用是显著的，使得原球茎的生长最大值提前了3 d，适量的富硒可促进原球茎的生长。之后由于原球茎纤维化程度开始不断提高，生长的活跃程度逐渐减弱，部分的原球茎细胞开始逐渐出现褐化衰老现象，最终导致原球茎鲜重的降低。30 d时收获能得到高质量的富硒原球茎细胞。

图2 最佳硒含量下培养天数对原球茎鲜重的影响Fig.2 Effect of cultivated days on fresh weight under optimum selenium concentration of protocorms

2.3.2 富硒原球茎多糖含量的变化曲线 由图3可知，铁皮石斛原球茎中的多糖含量呈现出先降低再增加最后又降低的趋势。在0～9 d内多糖含量有所下降，但从第12天开始，多糖含量开始增加，在30 d时达到最大，为34.79%，30 d后的多糖含量逐渐呈现下降的趋势。多糖不仅是细胞内储存能量的物质同时也是铁皮石斛原球茎的代谢产物，在刚继代到培养基时，原球茎的自身生长需要多糖的不断分解，导致多糖含量下降，之后在原球茎适应环境后，多糖不再分解消耗，细胞积累多糖使含量上升。而在培养后期，随着培养液中营养成分减少，需要分解多糖以提供原球茎细胞的生长和合成目的产物，导致多糖含量又开始下降。

图3 最佳硒含量下培养天数对原球茎多糖含量的影响Fig.3 Effect of cultivated days on polysaccharide content of protocorm under optimum selenium content

2.3.3 富硒原球茎生物碱含量的变化曲线 在富硒培养中，铁皮石斛原球茎生物碱含量变化如图4所示，生物碱含量总体上呈现迅速上升，之后开始缓慢下降的趋势。当培养天数为30 d时，生物碱含量达到最大，为0.026%，之后开始下降。

图4 最佳硒含量下培养天数对原球茎生物碱含量的影响Fig.4 Effect of cultivated days on alkaloid content of protocorm under optimum selenium content

2.3.4 富硒原球茎总蛋白质含量的变化曲线 铁皮石斛原球茎总蛋白质含量变化如图5所示，总蛋白质含量总体上呈现迅速上升后下降的趋势。随着培养时间的不断延长，蛋白质含量在逐渐减少，这可能与铁皮石斛原球茎纤维化程度不断提高、生长活跃程度逐渐减弱有关。即当培养天数30 d时，总蛋白含量达到最大，为28.25%，之后量逐渐开始下降。

图5 最佳硒含量下培养天数对原球茎总蛋白质含量的影响Fig.5 Effect of cultivated days on total protein content of protocorm under optimum selenium content

3 讨论

在本试验中添加0.05 mg·L-1的硒时，对原球茎生长起到促进作用，并能提高原球茎产量及产品品质，但过量硒(≥0.10 mg·L-1)又不利于原球茎的生长，会对原球茎产生不同程度的毒害作用。研究结果表明，当硒含量为0.05 mg·L-1时，富硒原球茎生长最佳。徐国华等[22]在研究中所用的培养基N6+0.5 mg·L-1NAA+3%蔗糖，与本研究所用培养基 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖相比，在MS培养基富硒0.05 mg·L-1条件下更利于原球茎富硒生长，并达到最大的硒含量4.01 mg·kg-1，硒参与到原球茎的新陈代谢，同时促进了原球茎的生长，提高了产量及其品质。

铁皮石斛原球茎多糖、生物碱、蛋白质含量的多少对原球茎品质起到决定性的作用。本研究所得到的多糖含量达到了34.79%，含量高于现有人工栽植或是野生铁皮石斛多糖含量。何铁光等[23]在对铁皮石斛不同来源材料的研究中，用1/2 MS液体培养基得到的铁皮石斛原球茎多糖含量为24.32%，而孙丹[24]通过固体培养基培养得到原球茎中多糖含量为21.42%，本研究富硒后多糖含量升高。已有的研究表明，原球茎中生物碱含量相较于人工栽培或是野生铁皮石斛偏低，本研究中富硒悬浮培养所得生物碱含量为0.026%,相较于张本厚等[20]由固体培养基培养所得到生物碱含量为0.018%高得多。而在试验中富硒后原球茎总蛋白质含量为28.25%，高于张本厚等[20]由固体培养基培养所得的22.19%。在尚庆茂等[25]研究硒营养对水培生菜品质的影响，杜振宇等[26]研究施硒对茄子品质的影响，倪蕾等[27]研究不同含量亚硒酸钠对水培苦苣的影响试验中，得出施加适量的硒元素可以提高蛋白质的含量，且硒元素对蛋白质的合成具有促进作用。本试验同样也证实了富硒原球茎悬浮培养促进了蛋白质的合成。

对于原球茎的培养周期，无论是否富硒培养，原球茎的生长曲线均呈现先快速再缓慢上升，接着平稳生长，最后开始缓慢下降的趋势。但富硒培养原球茎后，收获期提前了3 d，富硒后原球茎的增值系数从0.69提高到2.86,富硒促进了原球茎细胞的生长。

本研究通过富硒培养对原球茎生长、富硒、多糖、生物碱、总蛋白质等含量的影响进行了初步研究。富硒后，硒参与到原球茎的新陈代谢，促进了原球茎的生长，提高了原球茎的产量及其品质，成功建立了铁皮石斛原球茎富硒悬浮培养的技术体系。