番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的培养条件优化及发酵过程状态参数研究

郑雪芳，朱育菁，刘 波，葛慈斌

(福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福建 福州 350003)



番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的培养条件优化及发酵过程状态参数研究

郑雪芳，朱育菁，刘 波*，葛慈斌

(福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福建 福州 350003)

对番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458进行培养条件优化和发酵过程状态参数研究。采用摇瓶培养和单因素试验研究菌株FJAT-1458的培养条件，确定最适培养基为SPA(蛋白胨5 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO40.25 g·L-1)，最适培养温度为30℃，250 mL三角瓶最适装液量为35 mL。用50 L发酵罐发酵FJAT-1458，发酵过程中菌体数量呈现先升后降的变化趋势，FJAT-1458的生长可分为4个时期：0～6 h为发酵适应期、6～36 h为对数生长期、36～60 h为稳定生长期，72 h后为消亡期。发酵过程中，菌体的致病性指标-弱化指数变化小，介于0.832～0.855，方差分析表明其差异不显著，P>0.05；发酵液pH值从7.23上升至8.78；菌体细胞为短杆状，大小为(1.0～1.5)μm ×(0.5～0.8)μm，随着发酵进程，细胞颜色变深，发酵后期细胞开始变形、裂解。

番茄青枯病；青雷尔氏菌；植物疫苗；培养条件优化

由致病性青枯雷尔氏菌VirulentRalstoniasolanacearum引起的番茄青枯病是一种毁灭性的土传病害，广泛分布在热带和亚热带地区[1]。该病害堪称“植物癌症”，一旦发病就难以控制，甚至造成生产绝收，严重制约着番茄产业的发展和经济效益的提高[2]。植株大面积枯萎死亡和番茄产量的严重下降，轻病田块减产10%～30%，重病田块减产50%，目前，对该病害一些防治措施包括农业防治(如嫁接、抗病育种、土壤改良、轮作套种等)、化学防治、生物防治(如芽孢杆菌、链霉菌等生防菌的利用)等[3]，其中，抗病育种是防治番茄青枯病的理想途径，但由于青枯病原菌寄生范围广，国内外育种家虽作大量工作，但能供生产上使用的抗病品种不多[4]，化学防治见效快，但污染环境且危害人类健康，因此，有必要开辟更多的防治途径。

自1950年，人们陆续发现真菌、细菌、病毒等可诱导多种植物产生抵抗病菌的能力。这方面的研究逐渐成为植物病理学的热点领域，形成植物免疫学(学科代码210.6015)。2006年《Nature》刊登了名为“The plant immune system”的文章，将植物免疫及抗病性的研究推入一个高潮[5]。植物在受到病原菌侵染时会产生主动抗病性，在被侵染位点产生过敏反应(HR)并发出系统性信号，进而产生系统获得性抗性(SAR)或诱导系统抗性(ISR)[6-7]。近年来，针对“植物免疫系统”如接种无毒或弱毒的活体微生物或蛋白等来激发植物免疫系统的防卫反应，进而开发安全、高效、无残留的“植物疫苗”已成为研究热点[8]。

青枯雷尔氏菌存在严重的致病力分化现象[9-11]，可分化出强致病力、无致病力和过渡型菌株，研究发现无致病力菌株对番茄、茄子等茄科作物具有免疫抗病的功能，即在作物苗期预先接种无致病力菌株，菌株就会侵入植株体内，并随着植株的生长在体内繁殖增长，通过生长竞争阻碍病原菌的侵入，同时能诱导植株产生抗病反应，如防御酶活性的提高、抗病化合物的产生、防卫相关基因表达量的增加等，从而使植物免遭病害或减轻病害[12]。在前期研究中，我们构建青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株库，从中筛选到1株生物学特性稳定，对番茄青枯病防效好的菌株FJAT-1458[13]，盆栽试验防效可达100%，田间试验表明其对番茄青枯病防效达75%以上，拟利用该菌株研发青枯病植物疫苗。

生防菌制剂的规模化生产与应用，发酵技术是关键。为实现青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458在今后生产应用上的高效表达，降低能量和物料消耗，有必要对其发酵条件及发酵过程各参数进行检测。本研究主要通过对菌株FJAT-1458发酵培养基的选择、培养温度及通气量的选择，确定其最佳发酵条件，通过对菌株FJAT-1458发酵过程的状态参数pH值、菌体浓度和菌株弱化指数进行跟踪研究，了解该菌株的发酵变化规律，为提高发酵质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株FJAT-1458，分离自番茄青枯病田块的健康植株，由福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库保存。青枯雷尔氏菌固体培养基为TTC[14]：蛋白胨10 g，酪朊水解物1 g，葡萄糖5 g，琼脂17 g，1 000 mL蒸馏水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌20 min，灭菌后冷却至55℃左右加入已灭菌的1%的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)水溶液，其终浓度为0.005%。发酵培养基SPA：蛋白胨5 g，蔗糖20 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，1 000 mL蒸馏水，pH7.0～7.2；发酵培养基NA：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，1 000 mL蒸馏水，pH 7.0～7.2；发酵培养基LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，1 000 mL蒸馏水，pH 7.0～7.2。

1.2 菌株FJAT-1458培养液的制备

将菌株FJAT-1458活化于TTC培养基平板上，在30℃条件下培养48 h，挑取单菌落接种于装有35 mL SPA液体培养基的250 mL三角瓶中，于30℃，170 r·min-1摇床培养24 h，收集培养液，系列梯度稀释后涂布TTC平板，计算活菌体数。

1.3 菌株FJAT-1458发酵培养条件的确定

将上述制备的FJAT-1458培养液按1%的接种量(1)分别接种至SPA、NA和LB 3种培养基，3个重复，30℃、170 r·min-1摇床培养24 h，收集培养液；(2)接种至装有35 mL SPA培养基，分别置20、25、30、35和40℃，3个重复，170 r·min-1摇床培养24 h，收集培养液；(3)接种至装有15、25、35、45、55 mL SPA培养基的250 mL三角瓶中，3个重复，30℃、170 r·min-1摇床培养24 h，收集培养液。将收集的不同处理的培养液，系列梯度稀释后涂布TTC平板，计算菌株FJAT-1458的活菌数。

1.4 菌株FJAT-1458发酵过程状态参数的变化

1.4.1 菌株的发酵及样本采集 将菌株FJAT-1458的培养液按1%接菌量接种至装有40 L SPA培养基的50 L发酵罐中进行大容量发酵，控制发酵罐搅拌器转速为200 r·min-1、温度(30±1)℃。每隔12 h取样，检测发酵液各状态参数。

1.4.2 菌体浓度检测 各样本经系列梯度稀释后涂布TTC平板，计算活菌数。

1.4.3 弱化指数测定 采用刘波等的方法[15]测定菌株FJAT-1458在不同发酵时间的弱化指数，分析其在发酵过程致病力的变化。具体方法如下：随机选取FJAT-1458在TTC平板上的10个单菌落，在Leica M165FC电动荧光体视显微镜测量并计算弱化指数，取平均值。弱化指数(Attenuation index， AI)=菌落的红斑直径与菌落直径的比值，弱化指数小于0.65为强致病力菌株，弱化指数大于0.75为无致病力菌株，弱化指数0.65～0.75为过渡型菌株。

1.4.4 发酵液pH值测定 取20 mL发酵液，进行pH值检测，重复3次，取平均值。pH值测定仪为Starter 3C奥豪斯仪器有限公司生产。

1.4.5 电镜样品制备 收集菌株FJAT-1458在不同时间(6、24、48、72 h)的发酵液样本，取2～5 μL样本至铜网，静置2 min，滤纸吸干，滴适量2%磷钨酸染色30 s，自然晾干，于HT7700透射电镜下观察菌体形态并拍照。

1.5 数据处理

采用Excel软件对数据进行初步统计分析，并利用DPS软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株FJAT-1458发酵培养条件的确定

(1)培养基的确定：菌株FJAT-1458在SPA培养基中的生长最好，30℃、170 r·min-1摇床培养24 h的菌浓度为1.56×108cfu·mL-1，在LB培养基中的生长量与SPA培养基相当，为1.39×108cfu·mL-1，差异不显著，在NA培养基中的生长最差，菌浓度为0.93×108cfu·mL-1，与其在SPA和LB培养基中生长量差异达显著水平(表1)。确定菌株FJAT-1458的最适发酵培养基为SPA培养基。

(2)培养温度的确定：菌株FJAT-1458的生长温度为20～35℃，最适生长温度为30℃，该温度下，菌株生长量最大，达1.77×108cfu·mL-1，温度超过40℃时，菌株不能生长(表1)。因此，确定菌株FJAT-1458的最适培养温度为30℃。

(3)装液量的确定：结果见表1。菌株FJAT-1458在不同装液量的SPA培养基中，长势相当，差异不显著。在250 mL三角瓶中装液量35 mL时，菌株FJAT-1458的菌体浓度略高于其他装液量。可在菌株FJAT-1458发酵培养时选用此种装液量。

表1 植物疫苗菌株FJAT-1458在不同培养条件下的生长量

Table 1 Growth of avirulent strain, FJAT-1458, under varied culture conditions

测定项目FJAT-1458菌体浓度/(×108cfu·mL-1)培养基SPA1.56±0.12aNA0.93±0.05cLB1.39±0.11a温度20℃1.14±0.06bc25℃1.27±0.12b30℃1.77±0.10a35℃0.91±0.06c40℃0装液量15mL1.82±0.07a25mL1.75±0.07a35mL1.87±0.11a45mL1.77±0.04a55mL1.71±0.06a

注：同例不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。表2同。

2.2 菌株FJAT-1458发酵过程状态参数的变化

菌株FJAT-1458发酵过程各状态参数发生一定的变化，试验结果见表2。菌体数量呈现先升后降的变化趋势，0～6 h菌体浓度变化不大，为发酵适应期；6～36 h菌株FJAT-1458进入对数生长阶段，菌体浓度由6 h的1.37×108cfu·mL-1增至36 h的12.48×108cfu·mL-1，36～60 h菌株FJAT-1458进入稳定生长期，72 h后，菌体数量明显下降，为消亡期。菌株FJAT-1458在发酵过程中弱化指数无明显变化，其值为0.832～0.855，均大于0.8，为无致病力菌株。菌株FJAT-1458在发酵过程，发酵液pH值变化值从7.23的中性环境上升至8.78的弱碱性，可能与发酵过程分泌一些代谢物有关。

表2 植物疫苗菌株FJAT-1458发酵过程各参数变化

Table 2 Changes on parameters during fermentationprocess of avirulent strain, FJAT-1458

时间/hFJAT-1458菌体浓度/(×108cfu·mL-1)菌株弱化指数pH值01.12±0.07a0.84±0.03a7.23±0.01h61.37±0.15a0.84±0.01a7.51±0.01g123.05±1.56b0.84±0.03a8.27±0.01f249.37±1.02c0.85±0.01a8.53±0.03d3612.48±2.55d0.85±0.01a8.38±0.02e4811.72±1.82e0.85±0.01a8.72±0.01b6011.05±1.22f0.85±0.02a8.67±0.01c728.32±0.43g0.83±0.03a8.78±0.03a

2.3 菌株FJAT-1458发酵过程菌体形态的变化

利用透射电镜观察菌株FJAT-1458在发酵过程菌体细胞形态的变化。菌株FJAT-1458细胞为短杆状，菌体大小为(1.0～1.5)μm ×(0.5～0.8)μm。发酵适应期，菌体细胞颜色较浅，细胞膜完整，细胞边缘呈透明状(图1-A)；对数生长期观察到细胞分裂现象，细胞颜色加深，边缘呈透明状(图1-B)；发酵稳定期，观察到细胞已分裂两个独立的细胞(图1-C)；消亡期，部分细胞开始变形、裂解(图1-D)。

3 讨论与结论

植物疫苗防治作物青枯病具有安全无毒、无农残、对环境友好等特点，是今后生物农药发展的方向，前景广阔[8]。植物疫苗的推广应用必须建立在其工业化生产上，而工业化生产中降低成本是商家追求的最终目标，因此植物疫苗工业化生产的重要环节之一就是植物疫苗生产工艺和制备工艺研究[16]。菌株的摇瓶发酵条件优化试验是走向中试及工业化生产的必要步骤，本研究对植物疫苗菌株FJAT-1458的摇瓶发酵培养基和培养条件进行研究，结果发现， FJAT-1458在LB、SPA和NA培养基上均能生长，最适培养基为SPA，生长的温度范围为20～35℃，最适培养温度为30℃，通气量对其发酵效果影响不明显。有关生防细菌的培养条件研究有不少文献报道[17-19]，本研究中植物疫苗菌株FJAT-1458的培养条件与其他生防细菌的培养条件不同，如周青等[17]报道青枯病和根肿病生防细菌解淀粉芽胞杆菌ZBS2004最适培养基为NA，最适培养温度为35℃；马耀华等[18]报道石榴干腐病生防细菌解淀粉芽胞杆菌Z2的优化培养条件为温度27℃和LB培养基。说明不同种属甚至同种不同生境来源的细菌最优培养条件不同。菌株FJAT-1458培养条件的研究为该菌株的产业化和大田应用奠定基础。

微生物生长一般经历4个时期：适应期、对数期、稳定期和消亡期。车建美等[20]对青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91的生长曲线测定结果显示，菌株FJAT-91的对数生长期为5～15 h，之后进入稳定生长期。陈燕萍等[16]研究Tn-5转座子插入致弱菌株T8发酵过程菌株的生长周期，发现0～16 h为发酵适应期，对数生长期为24～32 h。本研究对植物疫苗菌株FJAT-1458发酵过程中生长周期的测定结果与陈燕萍等[16]相吻合，说明不同致病力的青枯雷尔氏菌生长速度不同，强致病力菌株较弱/无致病力菌株生长速度快，更早进入稳定生长期，因此，利用无致病力青枯雷尔氏菌研发植物疫苗防治作物青枯病时应该提早接种，最好在育苗时接种，使植株预先产生免疫抗病力，抵御病原菌侵染。

在自然条件下，青枯雷尔氏菌易发生致病力分化，传统对青枯雷尔氏菌的致病力测定采用接种盆栽苗的生物测定法，这种方法不但耗时而且不灵敏[21]。刘波等[12]建立了弱化指数作为青枯雷尔氏菌致病力的量化指标，将分离获得的青枯雷尔氏菌分为3个类型：无致病力菌株(AI>0.75)、过渡型菌株(AI=0.65～0.75)和致病性菌株(AI<0.65)[15]。本研究测定了菌株FJAT-1458在不同发酵时期的弱化指数，结果表明，菌株FJAT-1458在发酵过程弱化指数变化小，介于0.832～0.855，从生物学特性可视为变化无差异。

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(责任编辑：黄爱萍)

Optimization of Culture Conditionsand Analysis of Fermentation Process for Plant Vaccine-producing Bacterium, FJAT-1458

ZHENG Xue-fang, ZHU Yu-jing, LIU Bo, GE Ci-bin

(AgriculturalBio-resourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003,China)

Conditions to culture FJAT-1458,a bacterium that produces plant vaccine against the tomato bacterial wilt caused byRalstoniasolanacearum, were optimized by asingle factor experiment. They were determined to be the use of an SPA medium containing peptone 5 g·L-1,sugar 20 g·L-1, KH2PO40.5 g·L-1, and MgSO40.25 g·L-1at 30℃ with 35 mL of broth in a 250 mL shaking flask. Subsequently, in a 50 L fermentation tank, the fermentation was carried out and the process monitored. During the fermentation, the cell count on FJAT-1458 increased initially and followed by a gradual decline with a 4-stage growth period that included the adaptive (0-6 h), logarithmic (6-36 h), stationary (36-60 h), and decline phases (after 72 h). In addition, it was observed that(a) the pathogenicity indicator, attenuation index, of FJAT-1458 ranged from 0.832 to 0.855 showing no significant difference (P>0.05) throughout the entire process; (b) the pH of the fermentation broth increased from 7.23 to 8.78; (c) morphologically, the bacteria appeared to be(1.0-1.5)μm×(0.5-0.8)μm rods with a darkening color as the process proceeded; (d) the cellular secretion from the bacteria increased with time; and, (e) some of the bacterial cells deformed and lysed near the end of fermentation.

tomato bacterial wilt;Ralstoniasolanacearum; plant vaccine; culture condition optimization

2016-03-29初稿；2016-05-25修改稿

郑雪芳(1977-)，女，副研究员，博士，主要从事植物病害生物防治的研究(E-mail:zhengxuefangfz@163.com)

*通讯作者：刘波(1957-)，男，博士，研究员，主要从事生物技术和生物农药的研究(E-mail：liubofaas@163.com)

国家公益性行业(农业)科研专项(201303015)；福建省自然科学基金项目(2015J01103)；福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1018-8)

S 436

A

1008-0384(2016)08-858-05

郑雪芳，朱育菁，刘波，等.番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的培养条件优化及发酵过程状态参数研究[J].福建农业学报，2016，31(8)：858-862.

ZHENG X-F，ZHU Y-J，LIU B，et al.Optimization of Culture Conditionsand Analysis of Fermentation Process for Plant Vaccine-producing Bacterium, FJAT-1458[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：858-862.