人参皂苷Rg3对鼻咽癌肿瘤干细胞放疗增敏的作用研究

孙力人　何士方　王　锐



人参皂苷Rg3对鼻咽癌肿瘤干细胞放疗增敏的作用研究

孙力人何士方王锐

目的探讨人参皂苷Rg3对体外培养鼻咽癌肿瘤干细胞放疗敏感性的影响。方法采常规无血清悬浮培养法从鼻咽癌低分化细胞株CNE-2中筛选出鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群CNE-2S；采随机分组法将细胞分为人参皂苷Rg3组(15 μg/mL)、放疗组和人参皂苷Rg3(15 μg/mL)联合放疗组；人参皂苷Rg3干预4 h后，将三组细胞16 Gy放射线照射30 min，然后在培养箱内继续孵育1 d、2 d和3 d，再进行相关测定。MTT法检测各组CNE-2S细胞增殖抑制率；DAPI染色法检测各组CNE-2S细胞凋亡情况，并分析细胞的光密度和面密度变化；Elisa法检测各组CNE-2S细胞SOD水平。结果1 d、2 d和3 d，人参皂苷Rg3联合放疗组的细胞增殖抑制率以及细胞SOD水平均明显高于人参皂苷Rg3组和放疗组，而细胞光密度、面密度明显于人参皂苷Rg3和放疗组，比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论人参皂苷Rg3可显著提高CNE-2S细胞的放疗敏感性，其促进细胞SOD表达可能是其作用机制之一。

人参皂苷Rg3；鼻咽癌；肿瘤干细胞；增敏

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.003

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1053～1055)

鼻咽癌为耳鼻喉科常见病，临床资料显示大多数患者确诊时该病病情已是晚期阶段，且常伴随淋巴结转移[1]；调查显示，我国范围内鼻咽癌的5年生存率现已高达近74%[2]。

研究证实，中药可以减轻放疗的毒副反应，提高鼻咽癌的临床治疗效果[3]。本研究以鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群CNE-2S为研究对象，在体外实验中检测人参皂苷Rg3对鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群CNE-2S的放疗增敏作用。

1　材料与方法

1.1材料

人参皂苷Rg3(纯度96%)由上海阳光试剂有限公司提供；DMEM/F12培养基购于美国Gibco公司；胰蛋白酶，表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，溴化二甲噻唑二苯四氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜均为博士德工程有限公司产品；胎牛血清由杭州四季青公司生产；DAPI和山羊血清购于美国Sigma公司；AD340型酶标仪(美国，Beckman Coulter公司)；IX70-S8F型倒置相差显微镜(日本，OLYMPUS公司)。

1.2实验方法

1.2.1鼻咽癌肿瘤干细胞培养[4]采用无血清悬浮培养法从鼻咽癌低分化细胞株CNE-2中筛选出鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群CNE-2S；将CNE-2S 置于无血清DMEM/F12培养液(含2% B-27添加物，20 μg/L bFGF和hEGF，100 U/mL 青霉素)中，于37 ℃，5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，每2 d换培养液1次，连续培养7 d；再用胰酶消化，离心，无血清培养基重悬细胞，按1∶2比例进行传代，将细胞以2×105个接种于培养孔板进行培养。

1.2.2实验分组采用随机分组法将细胞分为3组：人参皂苷Rg3组(15 μg/mL)，放疗组和人参皂苷Rg3(15 μg/mL)联合放疗组，每组各10孔细胞；人参皂苷Rg3干预4 h后，将三组细胞用16 Gy放射线照射30 min，然后在培养箱内继续孵育1 d、2 d和3 d，再进行相关实验测定。

1.2.3MTT法测定细胞增殖[5]收集对数生长期CNE-2S细胞，调整细胞浓度为2×105个/孔，置于96孔板，每孔100 μL，每孔加入20 μL MIT液，于5%CO2的饱和湿度和37 ℃的培养箱中继续培养4 h；采用二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解，摇床混匀15 min，在全自动酶标仪(波长：490 nm)下测定各孔吸光度值(OD值)，按细胞抑制率(%)=[(对照组OD 值-治疗组OD 值)/对照组OD 值]×100%，算出细胞增殖抑制率；每次测定重复3遍，取平均值。

1.2.4CNE-2S细胞凋亡检测采用细胞核(DAPI)染色法测定，首先吸出培养板内液体，在每孔内加入约DAPI溶液(1∶1500)100 μL，于室温下继续孵育10 min，然后去除DAPI液，漂洗2次，荧光显微镜下观察并拍照；应用CMIAS-II 多功能真彩病理图像分析系统对细胞凋亡情况进行分析，每组随机挑选10张图片，每张图片随机挑选10个视野，测定视野下细胞的光密度和面密度，每次重复3次，结果取平均值。

1.2.5细胞总超氧化物歧化酶(SOD)测定采用Elisa法测定，重复3次，取平均值，检测试剂盒由上海远慕生物科技有限公司提供。

1.3统计学方法

应用SPSS 19.0软件包对实验数据进行处理，计量资料应用表示，采用单因素方差分析，P<0.05为比较差异有统计学意义。

2　结果

2.1MTT法检测各组CNE-2S细胞增殖抑制率

MTT 法检测结果显示：与人参皂苷Rg3组比较，放疗组和人参皂苷Rg3联合放疗组CNE-2S细胞增殖抑制率均呈上升趋势；孵育1 d、2 d和3 d，放疗组CNE-2S和人参皂苷Rg3联合放疗组细胞增殖抑制率均于单纯人参皂苷Rg3组(P<0.01)；且在孵育1 d、2 d和3 d，人参皂苷Rg3联合放疗组细胞增殖抑制率高于放疗组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表 1。

表1　三组CNE-2S细胞增殖抑制率

注：与同期人参皂苷Rg3组比较，a为P<0.01；与同期放疗组比较，b为P<0.01。

2.2DAPI染色法检测各组CNE-2S细胞凋亡情况

人参皂苷Rg3组中CNE-2S细胞核激发蓝色荧光的细胞数量多；放疗组中类似细胞减少；人参皂苷Rg3联合放疗组中CNE-2S细胞荧光减少更明显。与人参皂苷Rg3组比较，放疗组和人参皂苷Rg3联合放疗组细胞光密度和面密度值均呈下降趋势；在1 d、2 d和3 d，放疗组和人参皂苷Rg3联合放疗组细胞光密度和面密度值均小于单纯人参皂苷Rg3组(P<0.01)；且在孵育1 d、2 d和3 d，人参皂苷Rg3联合放疗组细胞光密度和面密度小于放疗组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2　三组细胞光密度和面密度比较±s,n=100)

注：与同期人参皂苷Rg3组比较，a为P<0.01；与同期放疗组比较，b为P<0.01。

2.3Elisa法检测各组CNE-2S细胞SOD水平

Elisa法检测CNE-2S细胞SOD水平结果显示：与人参皂苷Rg3组比较，放疗组和人参皂苷Rg3联合放疗组细胞SOD水平均呈升高趋势；在孵育1 d、2 d和3 d，放疗组和人参皂苷Rg3联合放疗组细胞SOD水平均高于单纯人参皂苷Rg3组(P<0.01)；且在孵育1 d、2 d和3 d，人参皂苷Rg3联合放疗组细胞SOD水平高于放疗组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表 3。

表3三组CNE-2S细胞SOD水平比较

组别孵育1d孵育2d孵育3d人参皂苷Rg3组35.44±3.7649.33±4.7251.62±5.65放疗组44.61±4.94a53.62±3.91a61.46±6.75a人参皂苷Rg3联合放疗组51.97±5.41ab60.15±6.13ab70.17±7.31ab

注：与同期人参皂苷Rg3组比较，a为P<0.01；与同期放疗组比较，b为P<0.01。

3　讨论

人参主要成分为人参皂苷，具有扶正祛邪之功效；国内外调查表明，人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用已得到广泛证实，如对肠癌、肝癌、骨髓瘤以及黑色素瘤等[6]；近年研究显示，人参皂苷Rg3可抑制人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2体外血管生成及其迁移能力[7]；然而，人参皂苷Rg3对鼻咽癌中肿瘤干细胞的作用或提高其对放疗增敏的疗效尚不知晓。本研究采取常规无血清培养方案从鼻咽癌低分化细胞株CNE-2中筛选出鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群CNE-2S；将CNE-2S 置于无血清DMEM/F12培养液中，于37 ℃5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，获得所需试验细胞。

依据临床放疗增敏剂的选用原则，选取对肿瘤细胞生长抑制率≤5%的低药物浓度；选用的低剂量人参皂苷Rg3单纯使用对鼻咽癌肿瘤干细胞的杀伤效应并不显著。结果显示，与人参皂苷Rg3和放疗组相比，在1 d、2 d和3 d后人参皂苷Rg3联合放疗能明显提高细胞增殖抑制率；DAPI染色法检测发现，人参皂苷Rg3联合放疗组较人参皂苷Rg3和放疗组CNE-2S细胞的荧光减少更明显，统计显示在1 d、2 d和3 d后人参皂苷Rg3联合放疗组细胞光密度和面密度少于人参皂苷Rg3和放疗组，比较差异有统计学意义(P<0.01)。以上实验结果均表明，人参皂苷Rg3联合放疗可明显提高鼻咽癌肿瘤干细胞对放疗的敏感性。

研究显示，体内自由基反应及其生成物过氧化脂质对细胞膜有损伤作用，因此存在致癌活性[8]；人体正常生理功能下，体内产生的自由基可被SOD 等清除，而在自由基反应增强情况下SOD 等抗氧化保护作用被损害，过氧化脂质水平显著升高；因此，SOD与肿瘤的发生、病程进展密切相关[9]。本实验结果显示，与人参皂苷Rg3和放疗组比较，在1 d、2 d和3 d，人参皂苷Rg3联合放疗组细胞SOD水平明显高于人参皂苷Rg3和放疗组，比较差异有统计学意义(P<0.01)。

综上所述，人参皂苷Rg3联合放疗体外干预鼻咽癌肿瘤干细胞可提高细胞的抑制率，促进细胞凋亡，故可增强放疗的增敏的作用；其促进细胞SOD表达可能与上述作用有关。

[1]韦军.多西他赛联合顺铂诱导化疗治疗Ⅲ、Ⅳa 期鼻咽癌的临床疗效〔J〕.实用癌症杂志2015,30(6):886-888.

[2]包德强,吴畅,李泳彗,等.初治鼻咽癌单纯常规外照射放疗的临床效果及其影响因素分析〔J〕.实用癌症杂志,2015,30(4):597-602.

[3]程剑华.中药减轻鼻咽癌放射治疗毒副反应的疗效观察〔J〕.实用癌症杂志,1991,6(1):52-54.

[4]冀天星,张鑫,李祥勇,等.鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群的分离及初步鉴定〔J〕.中国肿瘤临床,2013,40(13):754-757.

[5]Chistiakova IA,Polianskaia GG.Influence of human fetal m-

esenchymal stem cells on glioma cell proliferation.A consequence of cellular crosstalk〔J〕.Tsitologiia,2014,56(11):800-808.

[6]贺云龙,赵春波,鄂明艳,等.人参皂苷Rg3抗肿瘤作用机制的研究进展〔J〕.现代生物医学进展,2013,13(17):3397-3400.

[7]孔霞,尚九龙,周艳芳,等.人参皂苷Rg3对人鼻咽癌CNE-2细胞血管生成拟态及迁移能力的影响〔J〕.广东医学,2015,36(9):1314-1317.

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(编辑：吴小红)

Study of Ginsenoside Rg3 on Radiotherapy Sensitivity of Nasopharynx Cancer Stem Cells

SUNLiren,HEShifang,WANGRui.

LuwanBranchofShanghaiRuijingHospital,Shanghai,200020

ObjectiveTo investigate influence of ginsenoside Rg3 on radiotherapy sensitivity of nasopharynx cancer stem cells in vitro.MethodsNasopharyngeal cancer stem cell subset(CNE-2S) was screened out from an undifferentiated epithelial cell line of nasopharyngeal carcinoma(CNE-2S) by conventional serum-free suspension culture method.The study was divided into ginsenoside Rg3 group(15 μg/mL),radiotherapy group and ginsenoside Rg3 combined with radiotherapy group by randomized block method.Relevant experiments were determined after these steps.The 3 groups were at 16 gy radiation during the 30 minutes exposure and then cultivated for 1 day,2 days and 3 days with 4 hours intervention of ginsenoside Rg3.Cellular proliferation inhibition rate of CNE-2S in every group was detected by MTT method.Apoptosis of CNE-2S in each group was measured by DAPI staining method.optical density and area density were analyzed.Level of SOD of CNE-2S in every group was detected by Elisa method.ResultsCellular proliferation inhibition rate and level of SOD of cancer stem cells ginsenoside Rg3 combined with radiotherapy group were obviously higher than those of ginsenoside Rg3 group and radiotherapy group in 1 d,2 d,and 3 d.Optical density,area density of ginsenoside Rg3 combined with radiotherapy group were remarkably lower than those of ginsenoside Rg3 group and radiotherapy group with statistical significances(P<0.01).ConclusionGinsenoside Rg3 can evidently increase radiotherapy sensitivity of CNE-2S cells,and the increasing SOD levels may be one of mechanisms.

Ginsenoside Rg3；Nasopharyngeal cancer；Cancer stem cell；Hypersensitization

200020 上海瑞金医院卢湾分院

R739.63

A

1001-5930(2016)07-1053-03

2015-09-07

2016-06-03)