桧木醇对肾癌786-O细胞增殖及相关细胞因子的影响

崔　龙　赵　娟



桧木醇对肾癌786-O细胞增殖及相关细胞因子的影响

崔龙赵娟

目的从体外水平研究桧木醇(hinokitio1)的抗肾癌作用，探讨其作用机制。方法采用MTT法和流式细胞术检测桧木醇对肾癌786-O细胞增殖的抑制作用和促凋亡作用的影响；采用Western-blot检测桧木醇对人肾癌786-O细胞Caspase-3剪切体、LC3和P62蛋白表达水平的影响。以3-MA验证其抗癌作用与自噬作用的关系。结果桧木醇对肾癌786-O细胞增殖有显著抑制作用，主要是通过激活Caspase 途径对细胞凋亡进行诱导。同时桧木醇可以对肾癌786-O细胞进行诱导自噬发生，使LC3蛋白的表达量出现显著上调，而P62蛋白表达则显著下调。结论桧木醇能够显著抑制肾癌786-O细胞的增殖，而且可以通过过度激活细胞自噬促进肾癌细胞凋亡。

肾癌；786-O细胞；桧木醇；自噬

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.004

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1056～1058)

肾癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，在男性肿瘤中死亡率居第6位，在女性肿瘤中死亡率居第8位[1]。肾癌患者症状大多表现不明显，目前当确诊为肾癌时，患者中有20%～30%已经开始出现远处转移现象。肾癌的形成是一个相当复杂的病理过程，与遗传和环境因素有关，但是其中还包括了表观遗传学方面的异常，具体发病机制还有待进一步研究[2]。桧木醇(hinokitio1)，是提取于柏科植物的一种天然化合物[3]，通过国内外同行的多年研究发现其在抗菌、抗氧化、抗炎症反应和诱导分化等方面有重要的作用[4-5]，而近年对于其抗肿瘤的特性研究最为广泛，且其抗肿瘤作用可能与其DNA的凋亡和损伤诱导作用有关[6-8]。本研究主要在于探讨桧木醇是否有抗肾癌作用，并且对其可能的作用机制进行初步研究。

1　材料与方法

1.1实验材料

人肾癌细胞株786-O(来源于中国科学院细胞库)；桧木醇(来源于美国Sigma公司)；Z-VAD-FMK及3-MA(来源于美国Enzo公司)；RPMI 1640培养基(来源于美国Hyclone公司)；MTT检测试剂盒(来源于美国Invitrogen公司)；Lipofectamine 2000(来源于美国Invitrogen 公司)；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(来源于美国BD公司)；本研究中抗体均从美国Cell Signaling Technology公司购买。

1.2方法

1.2.1细胞培养人肾癌786-O细胞培养于含体积分数为10%的FBS及100 mg/L链霉素、 100 U/mL青霉素的RPMI-1640培养基中进行传代培养，培养基放置于37 ℃、5%(体积分数) CO2的培养箱中培养。实验分为：对照组(0 mmol/L桧木醇组)和实验组[加入不同浓度桧木醇(2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L)]。

1.2.2MTT检测细胞增殖当细胞处于对数增长期时，取出各组细胞震荡重悬离心使其在液体中分布均匀，调整细胞使其浓度为2×104个/ml，然后以100 μl/孔加入到96孔板中。各组设置5个重复。48 h作用后，准备好浓度为5 g/L的MTT溶液，每个孔加入20 μl MTT溶液，进行孵育4 h，吸弃上清液。随后向每个孔中加入DMSO 150 μl，置于振荡器上进行10 min震荡，使结晶全部溶解。在490 nm条件下用酶标仪进行光密度值(OD)测定，增殖率=试验组/对照组×100%。此次实验做3次重复。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡水平给予相应药物作用的细胞在培养48 h后，取出各组786-O细胞，进行PBS洗涤预冷，然后按1×10/mL的密度进行重悬，再各取500 μl细胞加入流式管，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，进行震荡离心，混合均匀后在避光的条件下放置15 min进行孵育，随后使用流式细胞仪定量对各组细胞凋亡情况进行检测，此次实验做3次重复。

1.2.4Western-blot 检测处理48 h后，吸弃培养基后，PBS冰浴冲洗，96孔板中加入RIPA裂解液。按照标准操作完成蛋白的提取。蛋白定量(BCA蛋白定量法)后，随后将5×蛋白上样缓冲液加入孔中，然后在95 ℃条件下进行煮10 min。SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到NC膜上，后以5%BSA将其封闭1 h。再加一抗于4 ℃放置过夜，用TBST洗膜后，加二抗后室温1 h孵育，随后ECL化学发光液5 min孵育，以Image Quant 凝胶成像系统仪对开展显影观察，用β-actin作内参。

1.3统计学分析

2　结果

2.1桧木醇对人肾癌786-O细胞的增殖抑制作用

MTT检测结果表明，当桧木醇浓度为2.5 μmol/L时，24 h药物处理使肾癌786-O细胞增殖活力受到显著抑制(P<0.05)，并且在本实验中肾癌786-O细胞桧木醇抑制作用呈现一定程度的药物浓度依赖性增长趋势，当桧木醇浓度分别为2.5、5.0、10.0 μmol/L，肾癌细胞的增殖率分别为62.8%、27.6%、14.2%。

2.2流式细胞仪检测肾癌786-O细胞凋亡的变化

为Annexin V/PI流式细胞术检测肾癌细胞死亡率结果表明，当给药浓度为2.5 μmol/L时，桧木醇作用24和48 h后，随着时间得增加，肾癌786-O细胞的死亡率也存在增加的趋势。2个时间点(桧木醇作用24、48 h后)Annexin V+/PI-细胞比率依次是1.03%和5.02%，Annexin V+/PI+比率依次是5.78%和24.8%。

2.3桧木醇对肾癌786-O细胞Caspase-3、LC3-Ⅱ、p62蛋白表达水平的影响

Caspase-3作为凋亡主要的最终执行者之一，细胞凋亡情况可以通过其含量高低直接反映出来[7]。经Western blot检测，在2.5 μmol/L桧木醇处理24 h后，肾癌786-O细胞Caspase-3蛋白含量显著升高(P<0.05)；LC3-Ⅱ蛋白的表达量有明显上升现象(P<0.05)，而P62蛋白的表达量有明显下降现象(P<0.05)。见表1。

表1　桧木醇对肾癌786-O细胞蛋白表达水平的影响

2.4桧木醇细胞增殖抑制作用与细胞自噬的关系

本研究中加入自噬上游抑制剂来进一步阐明桧木醇对肾癌细胞的抑制作用和自噬作用的关系。MTT实验结果如表2所示，2 mmol/L的3-MA 24 h能够显著抑制由2.5 μmol/L桧木醇带来的肾癌细胞增殖抑制作用(P<0.05)。其中3-MA是典型的自噬上游抑制剂，本结果提示，桧木醇的抗肿瘤作用可能与肿瘤细胞自噬作用有关。

表2　桧木醇与3-MA对肾癌786-O细胞生存率的影响/%

3　讨论

近年不少研究结果显示，肥胖和糖尿病等代谢性疾病的发生率不断升高带来的患者罹患肿瘤风险的不断提高。作为一种天然提取物，近年研究结果发现桧木醇具有抗肺癌、直肠癌和乳腺癌的作用[7-9]，然而对于肾癌的研究鲜有报道。本次研究结果表明桧木醇能够很大程度上对肾癌786-O细胞的增殖产生抑制作用(P<0.05)，且一定程度上呈现出剂量依赖性增长趋势，且其对肾癌细胞的凋亡有促进作用(P<0.05)。在2.5 μmol/L桧木醇处理24 h后，肾癌786-O细胞Caspase-3蛋白含量显著升高(P<0.05)，说明桧木醇带来的肾癌786-O细胞凋亡作用可能是通过Caspase途径来实现的；同时桧木醇处理后LC3-Ⅱ蛋白的表达量显著上升(P<0.05)，P62蛋白的表达量显著下降(P<0.05)。

近年来，自噬在生命科学及医学研究领域是一大热点。自噬主要有维持细胞内环境稳态和细胞能量代谢两个方面的作用。在自噬泡内，物质被酸性水解酶水解后形成糖原和脂肪酸等小分子物质，然后重新释放至胞质内，继续参与到物质的代谢功能或再循环的过程中[10]。

目前由于自噬的作用较为复杂，所以在肿瘤中的作用尚且不是很清楚[11]。在生理状态正常的情况下，自噬的抗癌作用主要通过清除受损的线粒体、胞内产生的ROS和错误的折叠蛋白，来对基因组的稳定性和DNA的完整性进行维持。然而在肿瘤发生后，自噬能够促进肿瘤细胞在低氧、低营养条件下的存活，主要通过给肿瘤细胞供给能量来实现[12]。近年，肿瘤治疗研究领域的新热点之一就是以自噬为靶点的肿瘤治疗。

自噬与细胞凋亡的关系及其机制目前还非常复杂不明。在自噬被抑制时，由于胞内合成底物非常缺乏以及代谢的严重障碍，而使细胞凋亡发生；然而当胞内严重激活自噬时，由于物质的过度消耗，从而也会导致细胞发生凋亡[13]。自噬的活化作用使LC3-Ⅰ发生酯化，从而LC3-Ⅱ型蛋白产生，且其定位于自噬泡，所以LC3蛋白可作为自噬检测一种标志蛋白。本次研究通过western blot检测结果表明，桧木醇处理肾癌786-O细胞后，P62蛋白的表达量显著下降(P<0.05)，而P62蛋白是细胞自噬活动的特异性底物之一。本次研究结果很可能是由于桧木醇引起细胞自噬被过度激活，使胞内物质消耗过度，从而导致肾癌786-O细胞凋亡。在本研究中，当肾癌细胞给予3-MA来进行抑制细胞自噬活动后，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，这一结果更加表明桧木醇对肾癌细胞的抗肿瘤作用与自噬作用有密切关系。

本研究证明了桧木醇在体外水平的抗肾癌作用，且初步发现其抗癌作用可能与细胞自噬被过度激活有关。

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(编辑：甘艳)

Effect of Hinokitol on Proliferation of RCC 786-O and Related Cytokines

CUILong，ZHAOJuan.

XiangyangCenterHospital，Xiangyang，441021

ObjectiveTo study the hinokitol anti-renal carcinoma effect in vitros，and explore the mechanism.Methods MTT and flow cytometry assay were used to detect the effect of hinokitol on RCC 786-O cell proliferation inhibition and apoptosis；assay hinokitol influence on RCC 786-O cells caspase-3 shear body，LC3 and p62 protein expression were detected by Western blot.To verify the relationship between the anti-cancer effect and autophagy by 3-MA.ResultsHinokitol can significantly inhibit the proliferation of human 786-O cells，induce cell apoptosis by activating Caspase pathway.At the same time hinokitol induced RCC 786-O cell autophagy，leading to LC3 protein expression was significantly up-regulated，while P62 protein expression was down regulated.ConclusionHinokitol can significantly inhibit the proliferation of RCC786-O cells，and excessive activation of autophagy can promote apoptosis of human renal carcinoma cell line.

Renal cell carcinoma；786-O cells；Hinokitol；Autophagy

441021 湖北省襄阳市中心医院

赵娟

R737.11

A

1001-5930(2016)07-1056-03

2015-08-10

2015-12-21)