健脾化瘀方对缺氧微环境下结肠癌SW480细胞生物学行为的影响＊

马宇霆，王 丹，王瑞平，邹 玺

1.南京中医药大学 第一临床医学院（南京 210023）；2.南京中医药大学 基础医学院（南京 210023）；3.江苏省中医院 肿瘤内科（南京 210029）

结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和死亡率均较高。近年来，结肠癌的发病率呈明显上升趋势［1］。邹玺等［2］认为结肠癌的病机以脾气虚弱、瘀毒内结为主，治法以健脾化湿、活血化瘀为主，并自拟以健脾化瘀法为主的中药煎剂辨证治疗各证型结肠癌。前期研究［3］发现，健脾化瘀方对人肝癌HepG2细胞、结肠癌LoVo细胞、人胃癌SGC－7901细胞的增殖及侵袭转移能力有明显抑制作用。越来越多的证据表明缺氧普遍存在于人类肿瘤中，随着实体瘤的发生发展，肿瘤内部不能得到足够的血液供应，导致局部处于缺血缺氧状态，使肿瘤组织内局部氧分压改变［4－5］。目前，恶性肿瘤病死率仍较高，常见的手术、放化疗及靶向治疗等方法均未能取得突破性进展，其原因主要是肿瘤细胞具有无限增殖、侵袭和转移的能力。本实验采用CoCl2刺激结肠癌SW480细胞，模拟肿瘤体内缺氧微环境，观察健脾化瘀方对缺氧微环境下SW480细胞增殖及侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

健脾化瘀方［6］：白术10g、地锦草15g、丹参15g、蚤休15g、莪术10g、半枝莲30g、茵陈15g，用1 100mL超纯水加热回流提取2次，合并药液进行浓缩处理，微波真空干燥，高温高压灭菌，配制成相当于生药浓度0.8g/mL的水提液，再用完全培养液稀释为0.2、0.4、0.8mg/mL，22μm微孔滤膜过滤。4℃冰箱保存备用。

RPMI－1640培养基购自南京凯基生物技术公司，氯化钴六水合物、胰蛋白酶粉、PBS粉购自美国Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物公司，MTT粉剂购自Biosharp公司，二甲基亚砜（DMSO）分析纯购自成都科隆化学品有限公司，FN胶和Matrigel胶购自美国密理博（Millipore）公司。

结肠癌SW480细胞购自南京凯基生物公司，用含10%胎牛血清及1%双抗的1640培养液常规培养，取对数生长期的细胞用于后续实验［6］。

1.2 方法

1.2.1 健脾化瘀方对缺氧条件下SW480细胞增殖能力的影响 采用MTT法测定，重复实验3次。实验分为空白组、CoCl2组、健脾化瘀方不同浓度（0.2、0.4、0.8mg/mL）处理组，每组设3个复孔。取对数生长期细胞，以6×103个/mL接种于96孔板，100μL/孔，培养24h，待细胞贴壁后弃去原培养液，空白组每孔加入200μL完全培养液，其余4组均加入同等剂量的CoCl2，使其终浓度为200μmol/L，健脾化瘀方不同浓度组加入适量健脾化瘀方，使其终浓度为0.2、0.4、0.8mg/mL。常规培养24h后，用PBS溶液小心清洗每孔3遍，将96孔板倒置于吸水纸上，吸干PBS溶液后，于每孔加入100μL 1640完全培养液和20μL MTT溶液，继续放入培养箱培养4h，吸去所有上清液，每孔加入150μL DMSO，水平振荡器避光振荡10min，使用酶标仪于波长490nm处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞抑制率［7－8］。抑制率（%）＝［1－（给药组A490值－空白组A490值）/（CoCl2组A490值－空白组A490值）］×100%。

1.2.2 健脾化瘀方对缺氧条件下SW480细胞黏附能力的影响 分组同上。取对数期细胞，消化，离心（离心半径6cm，800r/min，离心5min），并重悬于完全培养液中，调整细胞浓度为1×105个/孔，接种于96孔板中。待细胞贴壁后，给药，具体给药方式同1.2.1；继续培养30、60、90、120min。酶标仪测定490nm波长处各孔A值，观察健脾化瘀方对缺氧微环境下的结肠癌SW480细胞黏附能力的影响［9］。

1.2.3 健脾化瘀方对缺氧条件下SW480细胞侵袭能力的影响 分组同上。Matrigel胶和超纯水按1∶9稀释，并予50μL均匀平铺于每个Transwell小室底部，4℃风干过夜，待用。取对数期细胞，将培养皿中原有培养液弃去，换成含1%小牛血清的1640培养液饥饿细胞12h后，给药，具体给药方式同1.2.1。常规培养24h后，收集空白组皿中上清液，作为条件培养液，同时消化各组细胞，离心（离心半径6cm，800r/min，离心5min）计数，维持细胞浓度为1×106个/mL，用含1%小牛血清的培养液重悬细胞，每个上室加入约250μL细胞悬液，再向下室中加入300μL完全培养液，以及300μL条件培养液，继续培养24h后取出小室，吸去小室上室中的培养液，倒置小室，通风处风干，再用75%乙醇固定细胞，待自然风干后，用台盼蓝溶液对于穿透小室的细胞染色，自然风干。取出小室基底膜，载玻片固定，倒置显微镜下随机选择5个400倍视野，记录由小室迁移至基底膜下的细胞数量，计算细胞侵袭抑制率，对各组侵袭细胞拍照计数，统计各组差异，侵袭抑制率＝［（CoCl2组穿膜细胞数－健脾化瘀方不同浓度处理组穿膜细胞数）/CoCl2组穿膜细胞数］×100%［10］。

1.3 统计学方法

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用方差分析比较组间差异，进一步采用SNK法进行两两比较；定性资料采用百分比表示，采用χ2检验分析组间差异，检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 MTT法检测健脾化瘀方对缺氧SW480细胞增殖能力的影响

与空白组比较，缺氧条件下的人结肠癌细胞株SW480增殖能力明显下降，24h时，健脾化瘀方各浓度组对缺氧下的人结肠癌细胞株SW480的增殖有不同程度的抑制作用，但与CoCl2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；48h时，健脾化瘀方浓度为0.4、0.8mg/mL时，与 CoCl2组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表1 健脾化瘀方对缺氧SW480细胞增殖能力的影响（±s，%）

表1 健脾化瘀方对缺氧SW480细胞增殖能力的影响（±s，%）

注：与CoCl2组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别24h A 抑制率CoCl2＋复方0.8 0.65±0.12 54.55±4.53 0.57±0.11 66.07±6.68值 抑制率48h A 值＊＊CoCl2＋复方0.4 0.70±0.10 51.05±4.64 0.61±0.20 63.69±5.26＊CoCl2＋复方0.2 0.74±0.06 48.25±2.96 0.66±0.19 60.71±4.89 CoCl2 组 0.78±0.08 45.45±2.43 0.91±0.12 45.83±2.13空白组 1.43±0.11 － 1.68±0.14 －

2.2 MTT法检测健脾化瘀方对缺氧SW480细胞黏附能力的影响

CoCl2组较空白组黏附能力明显增强，且随时间增加而增强；各浓度健脾化瘀方作用于缺氧SW480细胞后，其黏附能力较CoCl2组减弱（P＜0.05，P＜0.01），且其黏附抑制能力随作用时间延长而逐渐增强（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

表2 健脾化瘀方对缺氧SW480细胞黏附能力的影响（±s，%）

表2 健脾化瘀方对缺氧SW480细胞黏附能力的影响（±s，%）

注：与CoCl2组比较，＊P＜0.05；与CoCl2＋复方0.2组比较，＃P＜0.01；与CoCl2＋复方0.4组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

抑制率CoCl2＋复方0.8 0.79±0.10 52.16±3.26＊＃△△ 0.83±0.06 55.89±5.56＊＃△ 0.89±0.08 62.44±6.13＊＃△ 0.83±0.08 70.25±7.41＊＃△组别30min A 值 抑制率60min A 值 抑制率90min A 值 抑制率120min A 值CoCl2＋复方0.4 1.23±0.12 24.68±3.83＊＃ 1.34±0.07 29.28±3.22＊＃ 1.44±0.07 37.87±4.32＊ 1.41±0.10 48.74±5.13＊＃CoCl2＋复方0.2 1.51±0.06 7.93±2.14＊ 1.59±0.08 15.31±2.81＊ 1.73±0.09 24.81±3.75＊ 1.87±0.11 32.16±4.37＊CoCl2 组 1.64±0.15 －20.16±1.36 1.88±0.21 －22.86±2.3 2.32±0.35 －25.29±1.41 2.73±0.40 －25.83±1.86空白组 1.36±0.11 － 1.53±0.15 － 1.85±0.22 － 2.17±0.17 －

2.3 Transwell小室法检测健脾化瘀方对缺氧SW480细胞侵袭能力的影响

CoCl2组较空白组侵袭细胞数明显增多（P＜0.01），各浓度的健脾化瘀方均能抑制SW480细胞的体外侵袭能力，各浓度组穿过Matrigel胶的细胞数随健脾化瘀方浓度的增大而减少，侵袭抑制率增大，差异有统计学意义（P＜0.01）（表3）。

表3 健脾化瘀方对缺氧SW480细胞侵袭能力的影响

3 讨论

缺氧是肿瘤组织发展到一定阶段后的生存状态，是影响肿瘤生长与转移的重要因素［11］。已有研究［12－14］表明，缺氧不仅能够诱导肿瘤细胞抗凋亡能力增强，还能够调节肿瘤血管生成，促进代谢和转移侵袭。本研究采用CoCl2处理SW480细胞，模拟肿瘤体内缺氧环境，观察健脾化瘀方对SW480细胞的增殖及侵袭转移能力的影响。

健脾化瘀方在临床治疗结肠癌中已取得一定疗效［15］。本研究表明，在化学模拟缺氧微环境下，结肠癌细胞SW480的增殖能力受到明显抑制，健脾化瘀方作用于缺氧微环境下的SW480细胞时，随健脾化瘀方浓度及作用时间的增加，其增殖抑制率升高，当药物浓度达到0.8mg/mL时，其抑制率最高；缺氧微环境下肿瘤细胞的黏附能力增强，导致肿瘤细胞发生转移的可能性明显增加，不同浓度健脾化瘀方均具有抑制缺氧诱导的人结肠癌细胞SW480黏附能力的作用，高浓度健脾化瘀方的黏附抑制能力明显高于低浓度，且随时间的延长，其黏附抑制能力有逐渐增强的趋势；缺氧环境下的SW480细胞侵袭能力较空白组明显增强，健脾化瘀方作用于缺氧诱导的人结肠癌细胞SW480后，其侵袭能力明显减弱，且随着健脾化瘀方浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。综上所述，健脾化瘀方在体外可明显抑制缺氧微环境下SW480细胞增殖及侵袭转移能力，呈一定的浓度依赖性，其具体分子机制尚待进一步研究。

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