银杏内酯B诱导人结直肠癌HCT116细胞凋亡的研究

杨 彬，沈树安，陈盛琼，李之令

1.凉山州第二人民医院 肛肠科（西昌 615000）；2.新疆特殊环境医学重点实验室（乌鲁木齐 830000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种人类常见的胃肠道恶性肿瘤［1］，其发生发展受染色体异常和基因突变等多因素调控，由于晚期恶性肿瘤转移，发病率和病死率均较高［2］。目前，CRC的治疗主要采取手术切除并辅以结直肠癌靶向药物，如奥沙利铂等，但CRC切除患者易发生远处转移，并且分子靶向药物仍存在较强的毒副作用［3］，因而筛选有价值的低毒有效的中草药成分是辅助CRC手术治疗的有效选择。银杏叶又名白果叶，具有化湿止泻、益心敛肺和治疗胸闷心痛等功效［4］。银杏内酯B（ginkgolide B，GB）是从银杏叶提取的二萜类化合物［5］，姜伟等［6］发现，GB能够显著增加耐药卵巢癌细胞株对顺铂的敏感性，可作为一种临床肿瘤化疗过程中的辅助性药物。有研究［7］进一步表明，GB进入癌细胞后可被代谢为小分子化合物，可能通过阻断肿瘤细胞线粒体融合，诱导凋亡因子的产生，促进肿瘤细胞凋亡。提示GB可能对人CRC细胞具有潜在的抗癌作用。本研究通过制备HCT116裸鼠瘤动物模型，观察GB对CRC生长的影响，并通过体外实验检测人CRC细胞增殖抑制率，观察其细胞形态和凋亡情况，探讨GB对人CRC细胞增殖和凋亡影响，并采用 Western blot法对人CRC HCT116 细 胞 内 Bcl－2 蛋 白（B－cell leukemia/lymphoma 2，Bcl－2）、Bax 蛋 白（Bcl－2－associated protein x，Bax）和线粒体融合蛋白1（mitofusin 1，Mfn1）的表达进行检测，旨在揭示GB促进人CRC细胞凋亡的可能机制，以期为人CRC的治疗提供新的中草药辅助治疗手段。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养

人CRC细胞系HCT116购自上海酶研生物科技有限公司，用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基对HCT116细胞进行培养，传代后接种于培养板中，分为4组，分别为阴性对照组（无药物处理）和GB处理组（终质量浓度分别为1、5、25mg/L），不同质量浓度的 GB处理细胞72h，每组做3个平行。

1.2 实验动物

4～5 周龄雌性BALB/c系裸鼠20只，体质量20～30g，购自四川大学华西医学实验动物中心，合格证号：SCXK（川）2014～10。

1.3 药物及主要试剂、仪器

GB购自上海江莱生物科技有限公司。胎牛血清、双抗和RPMI 1640培养基购自HyClone公司，噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，Giemsa染色剂购自上海浩然生物技术有限公司，Annexin V－FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL显色试剂购自R＆D公司，Bcl－2、Bax和Mfn1兔源一抗购自美国NovusBiologicals公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG购自上海研卉生物科技有限公司。细胞培养板购自成都宝信生物科技有限公司，ELx酶标仪由美国Bio－Tek Instruments Inc公司生产，旋转蒸发仪由德国Heidolph公司生产，电泳仪和转膜仪由上海俊仕生物科技有限公司生产，流式细胞仪由美国Beckman公司生产。

1.4 CRC裸鼠模型及处理

取对数生长期的 HCT116细胞200μL（含5×105个癌细胞）接种于20只裸鼠左腋皮下，1周后皮下实体瘤形成，随机分为4组，即阴性对照组（仅注射 DMSO）、低剂量组（5mg/kg）、中剂量组（10mg/kg）和高剂量组（20mg/kg），每组5只。裸鼠腹腔注射15μL DMSO 和5、10、20mg/kg GB，注射7次/周，共4周。观察各组裸鼠肿瘤生长情况，同时每周用游标卡尺测量各组裸鼠肿瘤的长径与短径，计算肿瘤的体积［4π/3×（短径/2）2×（长径/2）］［8］，并在注射第4周时，比较各组肿瘤质量的差异。

1.5 MTT法检测GB对人CRC细胞增殖的影响

取对数生长期的人CRC细胞HCT116接种于96孔培养板中，每孔细胞密度为2×103个，培养24h后，药物处理组分别加入不同质量浓度的GB（终质量浓度为1、5、25mg/L），阴性对照组每孔仅加入RPMI 1640培养液，另设一个阴性对照组（含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，无细胞）。37℃，5%CO2条件下，培养72h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，继续孵育4h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，摇床上震摇10min，酶标仪测570nm处各孔吸光度（A）值，每孔吸A值减去阴性对照孔A值即为各测试孔的实际A值。计算人CRC细胞增殖抑制率＝（1－实验组A值/阴性对照组A值）×100%。每组重复3次。

1.6 Giemsa染色观察CRC细胞形态

取对数生长期的人CRC细胞HCT116，药物处理组分别给予不同质量浓度的GB（终质量浓度为1、5、25mg/L）处理72h，酶消化后用灭菌PBS清洗3次，进行涂片和固定，Giemsa染色后观察人CRC细胞及其核的变化。

1.7 Annexin V/PI双染法观察CRC细胞凋亡

取对数生长期人CRC细胞HCT116接种于24孔板，37℃，5%CO2，培养24h后，药物处理组分别给予不同质量浓度的GB（终质量浓度为1、5、25mg/L）处理72h，阴性对照组仅加入RPMI 1640培养液。用不含EDTA的胰酶消化细胞后，4℃，以离心半径3cm，2 000r/min，离心5min，收集细胞。预冷灭菌PBS重悬浮细胞，4℃，以离心半径3cm，2 000r/min，离心5min，弃上清，洗3次。加入300μL的1×Binding Buffer悬浮细胞后，加入5μL的 Annexin V－FITC 混匀，避光，室温孵育15min，上机前5min，再加入5μL的PI染色，流式细胞仪检测，BD FACS Diva software v6.1.3 软件分析HCT116细胞的凋亡结果。

1.8 Western blot法检测Bcl－2、Bax和 Mfn1的表达

取对数生长期人CRC细胞HCT116接种于6孔板，37℃，5%CO2，培养24h后，药物处理组分别给予不同质量浓度的GB（终质量浓度为1、5、25mg/L）处理72h，阴性对照组仅加入RPMI 1640培养液。收集各组细胞后提取总蛋白并定量，进行SDS－PAGE电泳，电印迹转移法将胶内蛋白转移至纤维素膜，5%脱脂奶粉液摇床封闭2h，4℃，过夜孵育Bcl－2、Bax和 Mfn1一抗（稀释度1∶1 000），TBST洗膜6次，HRP标记的山羊抗兔IgG（稀释度1∶5 000）摇床孵育2h，TBST洗膜6次，ECL法显色，曝光，暗室中洗片，扫描后进行数据分析。实验重复3次。

图1 GB抑制裸鼠HCT116移植瘤的生长（±s）

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（ˉx±s）描述，各处理组与对照组之间比较采用Dunnett－t检验，检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 GB抑制裸鼠HCT116移植瘤的生长

腹腔注射GB 1周后，GB对移植瘤的体积无明显影响，然而随着作用时间的延长，不同剂量的GB均能够抑制移植瘤的生长（P＜0.05）。不同剂量的GB处理移植瘤4周后，GB能够显著降低移植瘤的质量（P＜0.05）（图1）。

2.2 GB抑制人CRC细胞增殖

细胞活性分析结果显示，1mg/L与5mg/L的GB对人CRC细胞的增殖抑制率无明显影响，25mg/L的GB能够显著提高人CRC细胞的增殖抑制率（P＜0.01）（图2）。

2.3 GB对人CRC细胞形态的影响

Giemsa染色结果显示，与阴性对照组相比，不同质量浓度（终质量浓度为1、5、25mg/L）的GB处理HCT116 72h后，5mg/L的GB可轻微导致HCT116细胞凋亡，出现较少多核、核碎裂细胞及凋亡小体。25mg/L的GB能够导致大部分HCT116细胞凋亡，多核、核碎裂细胞以及凋亡小体出现较多（图3）。

2.4 GB对人CRC细胞凋亡的影响

不同质量浓度的GB作用HCT116细胞72h后，随着GB浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增加。1mg/L的GB组，细胞凋亡率为3.2%；5mg/L的GB组，细胞凋亡率为5.4%；25mg/L的GB组，细胞凋亡率为47.8%（图4）。

图2 GB对人CRC细胞增殖的影响（±s）

图3 GB对人CRC细胞形态的影响（Giemsa×100）

图4 流式细胞仪检测GB对人CRC细胞凋亡的影响

2.5 GB对人CRC细胞Bcl－2、Bax和 Mfn1蛋白表达的影响

不同质量浓度的GB作用HCT116细胞72h后，随着GB浓度的升高，抗凋亡蛋白Bcl－2表达下降，促凋亡蛋白Bax表达上升，Mfn1表达下降。5mg/L和25mg/L的GB能够降低人CRC细胞HCT116Bcl－2蛋白的表达（P＜0.05）；25mg/L的GB能够升高人CRC细胞HCT116Bax蛋白的表达（P＜0.05），同时显著降低人CRC细胞HCT116 Mfn1蛋白的表达（P＜0.01），并呈现剂量依赖性（图5）。

3 讨论

CRC是一种常见的消化道恶性肿瘤，手术切除后残存的肿瘤细胞易出现异常增殖，可破坏病变周围的正常组织或器官，患者复发和转移的几率高于50%［9］。因而，及时对其进行手术切除并寻求具有抗癌细胞增殖的中草药对CRC患者的后期治疗具有重要意义。研究［10－11］发现，二萜内酯类化合物能够通过促进肿瘤细胞凋亡，抑制多种肿瘤细胞增殖，具有较好的抗肿瘤活性。GB是银杏叶提取物种生理活性最强的二萜类化合物，含有3个内酯环，能够用于防治转移性癌症［12］。Jiang等［13］研究表明，GB能够增加耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，可用于临床恶性肿瘤的治疗。因此，推测GB有可能通过促进人CRC细胞的凋亡，进而辅助性治疗人CRC。实验结果显示，GB能够抑制裸鼠瘤的生长，并呈现剂量依赖性，与上述结论相符，表明GB能够抑制人CRC细胞的生长。Hsuuw等［14］发现，GB可诱导胚囊细胞凋亡，抑制胚囊细胞增殖，提示GB具有一定的促凋亡作用。同时，De Feudis等［15］显示，GB能够高度抑制人胸腺癌细胞的增殖。故本研究通过体外培养人CRC细胞，以细胞增殖抑制率及细胞凋亡率作为研究指标，探讨GB对人CRC细胞的促凋亡作用。结果显示，不同质量浓度的GB处理人HCT116细胞72h后，GB能够显著抑制人CRC细胞增殖，随着GB浓度的升高，多核、核碎裂细胞和凋亡小体出现增多，同时人CRC细胞的凋亡率逐渐增加，呈剂量依赖性，表明GB能够促进人CRC细胞凋亡。为进一步从分子水平揭示GB促进人CRC细胞凋亡的可能调节机制，分别对HCT116细胞内Bcl－2蛋白、Bax蛋白和Mfn1蛋白进行了研究。

图5 GB对人CRC细胞Bcl－2、Bax和Mfn1蛋白表达的影响

细胞凋亡是一个受细胞内酶类、内源性基因及信号转导调控的瀑布式激活过程，细胞凋亡与增殖的动态平衡是多种生物维持其内环境功能平衡和稳定的生物学过程［16］。Bcl－2家族包含两类功能相互对立的蛋白，即具有拮抗细胞凋亡作用的Bcl－2蛋白和能够促进细胞凋亡的Bax蛋白［17］。Bcl－2家族等肿瘤基因均可参与对细胞凋亡的调节。研究［18］显示，Bcl－2蛋白属于凋亡抑制蛋白，能够通过阻止线粒体膜等部位细胞色素C的释放，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。在各种凋亡刺激信号如生长因子缺乏、病毒感染和DNA损伤等作用下，髓样分化因 子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、白介素受体相关激酶（interleukin receptor－associated kinase，IRAK）和Fas相关死亡结构域（Fas associated death domain，FADD）等介导凋亡信号的传导，调节转录因子磷酸化，进而抑制下游调节蛋白Bcl－2的表达和激活促凋亡蛋白Bax活性，导致细胞结构解体［19］。Rana等［20］发现，抗凋亡蛋白Bcl－2的低表达和促凋亡蛋白Bax的高表达能够促进CRC细胞的凋亡。本实验结果显示，不加GB处理的HCT116细胞Bcl－2蛋白水平较高，Bax蛋白水平较低，与上述结论相符。Bcl－2和Bax可组成一个动态调控体系，随着Bcl－2表达量的降低，渐多的Bax蛋白形成稳定的Bax/Bax同源二聚体，诱导细胞凋亡［21］。不同质量浓度GB处理HCT116细胞后，稳定的Bax/Bax二聚体增多，从而提示，GB可能通过调节人CRC细胞内Bcl－2和Bax的相对表达水平，不断增加Bax/Bax同源二聚体形成量，促进细胞凋亡。同时，在凋亡过程中，过表达的Bax能够与Mfn1相互作用，继而使线粒体发生片段化，不断损伤线粒体，阻断损伤线粒体的融合，诱导凋亡因子产生，导致细胞凋亡［22］。线粒体融合作为一种细胞外膜损伤的维护机制，可保护细胞免于凋亡［23］。因此，以 Mfn1蛋白作为研究目标，探讨GB是否能够通过抑制Mfn1蛋白的表达水平，阻断损伤线粒体的融合，促进人CRC细胞的凋亡。Western blot结果显示，不同质量浓度的GB处理人HCT116细胞72h后，GB能够显著降低CRC细胞内Mfn1蛋白的表达水平。

综上所述，GB可能通过降低人CRC细胞内Mfn1蛋白的表达，阻断线粒体融合，并降低人CRC细胞内抗凋亡蛋白Bcl－2的表达和增加促凋亡蛋白Bax的表达，促进癌细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。然而，关于GB对人CRC的具体作用机制尚需进一步研究。

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